Imagistica cu calciu - Calcium imaging

Imaginea cu calciu este o tehnică de microscopie pentru a măsura optic starea de calciu (Ca ²⁺ ) a unei celule , țesuturi sau medii izolate . Imaginea cu calciu profită de indicatorii de calciu, molecule fluorescente care răspund la legarea ionilor de Ca ²⁺ prin proprietăți de fluorescență. Există două clase principale de indicatori de calciu: indicatori chimici și indicatori de calciu codați genetic (GECI). Această tehnică a permis studii de semnalizare a calciului într-o mare varietate de tipuri de celule. În neuroni, activitatea electrică este întotdeauna însoțită de un aflux de ioni Ca ²⁺ . Astfel, imagistica cu calciu poate fi utilizată pentru a monitoriza activitatea electrică în sute de neuroni din cultura celulară sau la animale vii, ceea ce a făcut posibilă disecția funcției circuitelor neuronale .

Indicatori chimici

Schema unei configurații tipice pentru imagistica fluorescenței calciului a miocitelor cardiace izolate

Indicatorii chimici sunt molecule mici care pot chela ionii de calciu. Toate aceste molecule se bazează pe un omolog EGTA numit BAPTA , cu selectivitate ridicată pentru ionii de calciu (Ca ²⁺ ) versus ioni de magneziu (Mg ²⁺ ).

Acest grup de indicatori include fura-2 , indo-1 , fluo-3 , fluo-4 , Calcium Green-1.

Acești coloranți sunt adesea utilizați cu grupările carboxil chelatoare mascate ca esteri acetoximetilici , pentru a face molecula lipofilă și pentru a permite intrarea ușoară în celulă. Odată ce această formă a indicatorului se află în celulă, esterazele celulare vor elibera grupările carboxil și indicatorul va putea lega calciu. Forma acidă liberă a coloranților (adică fără modificarea esterului acetoximetilic) poate fi, de asemenea, injectată direct în celule printr-un microelectrod sau micropipetă care elimină incertitudinile cu privire la compartimentul celular care deține colorantul (esterul acetoximetilic poate pătrunde, de asemenea, în reticulul endoplasmatic și mitocondriile ). Legarea unui ion Ca ²⁺ la o moleculă fluorescentă indicatoare duce fie la o creștere a randamentului cuantic al fluorescenței, fie la o schimbare a lungimii de undă de emisie / excitație . Indicatorii fluorescenți chimici individuali Ca ²⁺ sunt utilizați pentru măsurători de calciu citosolic într-o mare varietate de preparate celulare. Prima imagistică Ca ^{2+ în} timp real (rata video) a fost efectuată în 1986 în celule cardiace folosind camere video intensificate. Dezvoltarea ulterioară a tehnicii cu ajutorul laserului scanarea microscoape confocal a relevat subcelulare Ca ²⁺ semnale sub forma de Ca ²⁺ scântei și Ca ²⁺ blips. Răspunsurile relative dintr-o combinație de indicatori fluorescenți chimici Ca ²⁺ au fost de asemenea folosite pentru a cuantifica tranzitorii de calciu în organitele intracelulare, cum ar fi mitocondriile .

Imagistica cu calciu, denumită și cartografierea calciului, este, de asemenea, utilizată pentru a efectua cercetări asupra țesutului miocardic. Cartarea calciului este o tehnică omniprezentă utilizată pe inimi întregi, izolate, cum ar fi specii de șoareci, șobolani și iepuri.

Indicatori de calciu codați genetic

Indicatorii de calciu codabili genetic (GECI) sunt instrumente puternice utile pentru imagistica in vivo a procesului celular, de dezvoltare și fiziologic. GECI-urile nu trebuie încărcate în celule; în schimb, genele care codifică aceste proteine ​​pot fi ușor transfectate pe linii celulare. De asemenea, este posibil să se creeze animale transgenice care exprimă colorantul în toate celulele sau selectiv în anumite subtipuri celulare. GECI au fost utilizate în studiile neuronului, celulelor T , cardiomiocitelor etc. În linii mari, GECI pot fi împărțite în clase în care detectarea calciului se bazează pe fluorescență sau luminescență; cu toate acestea, ambele se bazează inevitabil pe proteine ​​fluorescente ca raportori, inclusiv proteina fluorescentă verde GFP și variantele sale (eGFP, YFP, CFP).

Dintre variantele fluorescente, sistemele cu indicatori de calciu pot fi împărțite în continuare în sisteme de proteine ​​fluorescente unice (FP) și sisteme de proteine ​​fluorescente asociate. Camgaroos a fost una dintre primele variante dezvoltate care implică un singur sistem proteic. Camgaroos profită de calmodulină (CaM), o proteină de legare a calciului. În aceste structuri, CaM este inserat în mijlocul proteinei fluorescente galbene (YFP) la Y145. Studiile anterioare de mutageneză au arătat că mutațiile din această poziție conferă stabilitate pH menținând în același timp proprietățile fluorescente, făcând din Y145 un punct de interes de inserție. În plus, capetele N și C ale YFP sunt legate printr-un linker peptidic (GGTGGS). Când CaM se leagă de Ca2 +, pKa efectiv este redus, permițând deprotonarea cromoforului. Acest lucru are ca rezultat o fluorescență crescută la legarea calciului într-un mod intensiometric. O astfel de detectare este în contrast cu sistemele ratiometrice, în care există o modificare a spectrelor de absorbție / emisie ca urmare a legării Ca2 +. Un sistem single-FP dezvoltat ulterior, denumit G-CaMP , invocă, de asemenea, GFP permutat circular. Una dintre extremități este fuzionată cu CaM, iar cealaltă extremitate este fuzionată cu M13 (domeniul de legare a calmodulinei a miozinei lumină kinază). Proteina este concepută astfel încât capetele termice să fie aproape în spațiu, permițând legarea Ca2 + să provoace modificări conformaționale și modulația cromoforului, permițând o fluorescență crescută. G-CaMP și variantele sale rafinate au valori nanomolare pentru afinitatea de legare. O variantă finală de proteină unică este CatchER, care este în general considerată a fi un indicator de afinitate mai mică. Buzunarul său de legare a calciului este destul de negativ; legarea cationului ajută la protejarea concentrației mari de sarcină negativă și permite fluorescența recuperată.

Spre deosebire de aceste sisteme, există sisteme de proteine ​​fluorescente asociate, care includ cameleonii prototipici . Cameleonii constau din două proteine ​​fluorescente diferite, CaM, M13 și un linker glicilglicină. În absența Ca2 +, doar proteina fluorescentă donatoare modificată în albastru va fi fluorescentă. Cu toate acestea, o schimbare conformațională cauzată de legarea calciului repoziționează proteina fluorescentă cu schimbare roșie, permițând ca FRET (Forster rezonanță de transfer de energie) să aibă loc. Indicatorii Cameleon produc un semnal ratiometric (adică eficiența FRET măsurată depinde de concentrația de calciu). Variantele originale ale cameleonilor au fost inițial mai sensibile la Ca2 + și au fost stinse de acid. Astfel de neajunsuri au fost abrogate de mutațiile Q69K și V68L. Ambele reziduuri erau apropiate de cromoforul anionic îngropat și aceste mutații împiedică probabil protonația, conferind o rezistență mai mare la pH.

O importanță crescândă în detectarea calciului sunt GECI aproape IR (NIR), care pot deschide căi pentru multiplexarea diferitelor sisteme de indicatori și permiterea unei penetrări mai profunde a țesuturilor. NIR se bazează pe proteine ​​fluorescente care leagă biliverdina, care sunt în mare parte derivate din fitocromi bacterieni . Sistemele NIR sunt similare cu pericamele inGCverse prin aceea că ambele experimentează o scădere a fluorescenței la legarea Ca2 +. RCaMP-urile și RGECO-urile sunt funcționale la 700+ nm, dar sunt destul de slabe și au o dispersie ridicată. Un analog Cameleon care implică NIR FRET a fost de asemenea construit cu succes.

O clasă specială de GECI este concepută pentru a forma o etichetă fluorescentă permanentă în neuronii activi. Acestea se bazează pe proteina Eos care poate fi fotografiată, care se transformă din verde în roșu prin scindarea coloanei vertebrale fotocatalizate (cu lumină violetă). Combinat cu CaM, lumina violetă fotoconverteste doar neuronii care au niveluri ridicate de calciu. SynTagMA este o versiune sinapsă a CaMPARI2.

În timp ce sistemele fluorescente sunt utilizate pe scară largă, reporterii bioluminiscenți Ca2 + pot avea, de asemenea, potențial datorită capacității lor de a abroga autofluorescența, albirea fotocalică [nu este necesară lungimea de undă de excitație], degradarea biologică și toxicitatea, pe lângă rapoarte mai mari semnal-zgomot. Astfel de sisteme se pot baza pe aequorin și pe luciferin celenterazină. Legarea Ca2 + provoacă o schimbare conformațională care facilitează oxidarea coelenterazinei. Fotoprodusul rezultat emite lumină albastră pe măsură ce revine la starea de bază. Colocalizarea aequorinei cu GFP facilitează BRET / CRET (Bioluminescență sau Chemiluminescență Rezonanță Transferul Energiei), rezultând o creștere a luminozității de 19 - 65. Astfel de structuri pot fi utilizate pentru a testa concentrațiile de calciu milimolar până la nanomolar. Un sistem similar invocă obelina și celifereramida sa de luciferină, care poate avea timp de răspuns mai rapid la calciu și insensibilitate la Mg2 + decât omologul său de aqueorină. Astfel de sisteme pot utiliza, de asemenea, auto-asamblarea componentelor luciferazei. Într-un sistem numit „nano-lanternă”, luciferaza RLuc8 este împărțită și plasată pe diferite capete ale CaM. Legarea calciului aduce componentele RLuc8 în imediata apropiere, reformând luciferaza și permițându-i să se transfere la o proteină fluorescentă acceptor.

Pentru a minimiza deteriorarea celulelor vizualizate, microscopia cu doi fotoni este adesea invocată pentru a detecta fluorescența de la reporteri. Utilizarea lungimilor de undă aproape de IR și minimizarea răspândirii axiale a funcției punctului permite rezoluția nanometrică și pătrunderea profundă în țesut. Gama dinamică este adesea determinată din astfel de măsurători. Pentru indicatorii non-ratiometrici (de obicei indicatori proteici singulari), este raportul intensităților de fluorescență obținute în condiții saturate de Ca2 +, respectiv, sărăcite. Cu toate acestea, pentru indicatorii ratiometrici, intervalul dinamic este raportul dintre raportul maxim de eficiență FRET (calciu saturat) și raportul minim de eficiență FRET (calciu epuizat). O altă cantitate obișnuită utilizată pentru a măsura semnalele produse de fluxurile de concentrație de calciu este raportul semnal-linie de bază (SBR), care este pur și simplu raportul modificării fluorescenței (F - F0) peste fluorescența de bază. Acest lucru poate fi legat de SNR (raport semnal / zgomot) prin înmulțirea SBR cu rădăcina pătrată a numărului de fotoni numărați.

O clasă specială de indicatori de calciu codați genetic sunt concepute pentru a forma o etichetă fluorescentă permanentă în neuronii activi. Acestea se bazează pe proteina fotografică mEos care se transformă din verde în roșu atunci când este iluminată cu lumină violetă. Combinat cu senzorul de calciu calmodulină , lumina violetă fotoconvertește numai neuronii care au niveluri ridicate de calciu. SynTagMA este o versiune sinapsă a CaMPARI2.

Utilizare

Indiferent de tipul de indicator utilizat, procedura de imagistică este în general foarte similară. Celulele încărcate cu un indicator sau care îl exprimă în cazul unui GECI, pot fi vizualizate folosind un microscop cu fluorescență și capturate de o cameră științifică CMOS (sCMOS) sau de o cameră CCD . Microscoapele confocale și cu doi fotoni oferă capacitatea de secțiune optică, astfel încât semnalele de calciu să poată fi rezolvate în microdomenii precum spini dendritici sau boutoni sinaptici , chiar și în probe groase, cum ar fi creierele de mamifere. Imaginile sunt analizate prin măsurarea modificărilor intensității fluorescenței pentru o singură lungime de undă sau două lungimi de undă exprimate ca raport (indicatori ratiometrici). Dacă este necesar, intensitățile și raporturile fluorescenței derivate pot fi reprezentate grafic față de valorile calibrate pentru nivelurile cunoscute de Ca ²⁺ pentru a măsura concentrațiile absolute de Ca ²⁺ . Metodele de microscopie pe câmp luminos extind citirea funcțională a capacităților de activitate neuronală în volume 3D.

Referințe

Lecturi suplimentare

• Nuccitelli, Richard, ed. (1994). „Un ghid practic pentru studiul calciului în celulele vii” . Metode în biologie celulară. Boston: Academic Press. ISBN 978-0-12-564141-8.