ADN fetal fără celule - Cell-free fetal DNA

ADN-ul fetal fără celule ( cffDNA ) este ADN-ul fetal care circulă liber în sângele matern . Sângele matern este prelevat prin puncție venoasă . Analiza ADNc-cff este o metodă de diagnostic prenatal neinvaziv comandată frecvent pentru femeile însărcinate de vârstă maternă avansată . La două ore după naștere, ADNc-cff nu mai este detectabil în sângele matern.

fundal

ADN-ul fetal fără celule se varsă în circulația sângelui matern.

cffDNA provine din trofoblaste placentare . ADN-ul fetal este fragmentat atunci când microparticulele placentare sunt vărsate în circulația sângelui matern .

fragmentele de ADNcff au o lungime de aproximativ 200 de perechi de baze (bp). Sunt semnificativ mai mici decât fragmentele de ADN matern. Diferența de mărime permite ca ADNcff să fie diferențiat de fragmentele de ADN matern.

Aproximativ 11-13,4% din ADN-ul fără celule din sângele matern este de origine fetală. Suma variază foarte mult de la o femeie însărcinată la alta. cffDNA este prezent după cinci până la șapte săptămâni de gestație. Cantitatea de cffDNA crește pe măsură ce sarcina progresează. Cantitatea de cffDNA din sângele matern scade rapid după naștere. La două ore după naștere, ADNc-cff nu mai este detectabil în sângele matern.

Analiza ADNc-cff poate furniza un diagnostic mai precoce al afecțiunilor fetale decât tehnicile actuale. Deoarece ADNcff se găsește în sângele matern, eșantionarea nu prezintă niciun risc asociat de avort spontan . analiza cffDNA are aceleași probleme etice și practice ca și alte tehnici, cum ar fi amniocenteza și eșantionarea villusului corionic .

Unele dezavantaje ale eșantionării cffDNA includ o concentrație scăzută de cffDNA în sângele matern; variația cantității de cffDNA între indivizi; o concentrație mare de ADN liber de celule materne comparativ cu ADNcff în sângele matern.

Noi dovezi arată că rata eșecului testului ADNc-cff este mai mare, fracția fetală (proporția ADN-ului fetal față de cel matern în eșantionul de sânge matern) este mai mică și PPV pentru trisomii 18, 13 și SCA este scăzută la sarcinile cu FIV comparativ cu cele concepute spontan.

Metode de laborator

Au fost dezvoltate o serie de metode de laborator pentru screening-ul ADN-ului fetal fără celule pentru depistarea defectelor genetice. Principalele sunt (1) secvențierea masivă a puștii în paralel (MPSS), (2) secvențierea masivă în paralel (t-MPS) și (3) abordarea bazată pe polimorfismul cu un singur nucleotid (SNP).

O probă de sânge periferic matern este prelevată prin venezecție la aproximativ zece săptămâni de gestație.

Separarea cffDNA

Plasma de sânge este separată de proba de sânge matern utilizând o centrifugă de laborator . ADNc-cff este apoi izolat și purificat. Un protocol standardizat pentru a face acest lucru a fost scris printr-o evaluare a literaturii științifice . Cel mai mare randament în extracția ADNc-cff a fost obținut cu „QIAamp DSP Virus Kit”.

Adăugarea de formaldehidă la probele de sânge matern crește randamentul ADNc-cff. Formaldehida stabilizează celulele intacte și, prin urmare, inhibă eliberarea ulterioară a ADN-ului matern. Odată cu adăugarea de formaldehidă, procentul de cffDNA recuperat dintr-o probă de sânge matern variază între 0,32 la sută și 40 la sută, cu o medie de 7,7 la sută. Fără adăugarea de formaldehidă, procentul mediu de cffDNA recuperat a fost măsurat la 20,2 la sută. Cu toate acestea, alte cifre variază între 5 și 96 la sută.

Recuperarea ADNc-cff poate fi legată de lungimea fragmentelor de ADN. O altă modalitate de a crește ADN-ul fetal se bazează pe lungimea fizică a fragmentelor de ADN. Fragmentele mai mici pot reprezenta până la șaptezeci la sută din totalul ADN-ului liber de celule din proba de sânge matern.

Analiza ADNc-cff

În PCR în timp real, sondele fluorescente sunt utilizate pentru a monitoriza acumularea de ampliconi . Semnalul fluorescent al reporterului este proporțional cu numărul de ampliconi generați. Cel mai adecvat protocol PCR în timp real este conceput în funcție de mutația particulară sau genotipul care trebuie detectat. Mutațiile punctuale sunt analizate cu PCR calitativă în timp real cu utilizarea sondelor specifice alelei . inserțiile și ștergerile sunt analizate prin măsurători de dozare utilizând PCR cantitativă în timp real.

ADNcff poate fi detectat prin găsirea secvențelor ADN moștenite paternal prin reacția în lanț a polimerazei (PCR).

PCR cantitativ în timp real

gena Y regiune determinantă a sexului (SRY) și tandemul scurt al cromozomului Y repetă „DYS14” în ADNcff din 511 sarcini au fost analizate folosind PCR cantitativă în timp real (RT-qPCR). În 401 din 403 sarcini în care sângele matern a fost extras la șapte săptămâni de gestație sau mai mult, au fost găsite ambele segmente de ADN.

PCR imbricat

Utilizarea reacției în lanț a polimerazei imbricate (PCR imbricată) a fost evaluată pentru a determina sexul prin detectarea unui semnal specific cromozomului Y în ADNcff din plasma maternă. PCR imbricat a detectat 53 din 55 de fetiți masculi. ADNc-ul cffD din plasma a 3 din 25 de femei cu făt feminin conținea semnalul specific cromozomului Y. Sensibilitatea PCR nested în acest experiment a fost de 96 la suta. Specificitatea a fost de 88 la sută.

PCR digital

Dispozitivele microfluidice permit cuantificarea segmentelor de ADNcff în plasma maternă cu precizie dincolo de cea a PCR în timp real. Mutațiile punctuale , pierderea heterozigoității și aneuploidia pot fi detectate într-o singură etapă PCR. PCR digital poate face diferența între plasma sanguină maternă și ADN-ul fetal într-un mod multiplex .

Secvențierea pușcării

Secvențierea pistolului cu randament ridicat folosind instrumente precum Solexa sau Illumina, produce aproximativ 5 milioane de etichete de secvență per probă de ser matern. Sarcinile aneuploide, cum ar fi trisomia, au fost identificate la testarea în a paisprezecea săptămână de gestație. Fetal întreg de cartografiere a genomului prin parental haplotip analiza a fost completată folosind secvențierea cffDNA din serul matern. Femeile însărcinate au fost studiate folosind o secvențare a ADN-ului plasmatic matern paralel masiv cu 2-plex și trisomia a fost diagnosticată cu scor z mai mare de 3. Secvențierea a dat sensibilitate de 100%, specificitate de 97,9%, o valoare predictivă pozitivă de 96,6% și o valoare negativă valoare predictivă de 100%.

Spectrometrie de masa

Desorbție / ionizare cu laser asistată prin matrice - spectrometrie de masă timp de zbor (MALDI-TOF MS) combinată cu extensie cu bază simplă după PCR permite detectarea ADNc-cff cu specificitate de bază singură și sensibilitate a moleculei de ADN unic. ADN-ul este amplificat prin PCR. Apoi, amplificarea liniară cu reacție de extensie a bazei (cu un al treilea grund) este concepută pentru a se recoacea în regiunea din amonte de locul mutației . Una sau două baze sunt adăugate la primerul de extensie pentru a produce doi produse de extensie din ADN de tip sălbatic și ADN mutant. Specificitatea bazei unice oferă avantaje față de tehnicile bazate pe hibridizare folosind sonde de hidroliză TaqMan . La evaluarea tehnicii, nu s-au găsit falsuri pozitive sau negative atunci când s-a căutat ADNcff pentru a determina sexul fetal în șaisprezece probe de plasmă maternă. Sexul a nouăzeci și unu de fetiți masculi a fost detectat corect folosind spectrometria de masă MALDI-TOF. Tehnica a avut precizie, sensibilitate și specificitate de peste 99%.

Modificări epigenetice

Diferențele în activarea genelor între ADN-ul matern și cel fetal pot fi exploatate. Modificările epigenetice ( modificări ereditare care modifică funcția genei fără a schimba secvența ADN) pot fi utilizate pentru a detecta ADNc-cff. Hypermethylated RASSF1 Un promotor este un marker universal fetal folosit pentru a confirma prezența cffDNA. A fost descrisă o tehnică în care ADNcff a fost extras din plasma maternă și apoi digerat cu enzime de restricție sensibile la metilare și insensibile . Apoi, s-a făcut analiza PCR în timp real a RASSF1A, SRY și DYS14. Procedura a detectat 79 din 90 (88 la sută) probe de sânge matern în care a fost prezent RASSF1A hipermetilat.

ARNm

Transcrierile ARNm din gene exprimate în placentă sunt detectabile în plasma maternă. În această procedură, plasma este centrifugată, astfel încât apare un strat apos. Acest strat este transferat și din acesta se extrage ARN . RT-PCR este utilizat pentru a detecta o expresie selectată de ARN. De exemplu, lactogenul placentar uman (hPL) și beta-hCG mARN sunt stabile în plasma maternă și pot fi detectate. (Ng și colab. 2002). Acest lucru poate ajuta la confirmarea prezenței ADNcff în plasma maternă.

Aplicații

Discernământ sexual prenatal

Analiza cffDNA dintr-un eșantion de plasmă maternă permite discernământul sexual prenatal . Aplicațiile discernământului sexual prenatal includ:

  • Testarea bolilor : dacă sexul fătului este de sex masculin sau feminin, permite determinarea riscului unei anumite tulburări genetice recesive legate de X într-o anumită sarcină, în special în cazul în care mama este purtătoare genetică a tulburării.
  • Pregătirea , pentru orice aspect al părinților, dependent de sex.
  • Selecția sexului , care după diagnosticul genetic preimplantator poate fi efectuată prin selectarea doar a embrionilor din sexul preferat sau, după metodele post-implantare prin efectuarea avortului selectiv în funcție de rezultatul testului și de preferințele personale.

În comparație cu ultrasonografia obstetrică care nu este fiabilă pentru determinarea sexului în primul trimestru și amniocenteza care prezintă un risc mic de avort spontan , eșantionarea plasmei materne pentru analiza ADNcff este fără risc. Principalele ținte din analiza cffDNA sunt gena responsabilă pentru proteina Y (SRY) care determină sexul pe cromozomul Y și secvența DYS14.

Hiperplazia suprarenală congenitală

În hiperplazia suprarenală congenitală , cortexul suprarenal lipsește sinteza adecvată a corticosteroizilor, ceea ce duce la exces de androgeni suprarenali și afectează făturile feminine. Există o masculinizare externă a organelor genitale la fătul feminin. Mamelor fetușilor cu risc li se administrează dexametazonă la 6 săptămâni de gestație pentru a suprima eliberarea de androgeni a glandei pituitare .

Dacă analiza ADNc-cff obținută dintr-un eșantion de plasmă maternă nu are markeri genetici găsiți doar pe cromozomul Y, aceasta sugerează un făt feminin. Cu toate acestea, ar putea indica și un eșec al analizei în sine (un rezultat fals negativ). Polimorfismele genetice paterne și markerii independenți de sex pot fi utilizați pentru a detecta ADNc-cff. Pentru această aplicație trebuie să existe un grad ridicat de heterozigoitate a acestor markeri.

Testarea paternității

Testarea prenatală a paternității ADN este disponibilă comercial. Testul poate fi efectuat la nouă săptămâni de gestație.

Tulburări genetice unice

Tulburările autozomale dominante și recesive ale unei singure gene care au fost diagnosticate prenatal prin analiza ADN-ului moștenit patern includ fibroza chistică , beta talasemia , anemia cu celule secera , atrofia musculară spinală și distrofia miotonică . Diagnosticul prenatal al tulburărilor cu o singură genă care se datorează unei mutații autozomale recesive, a unei mutații autozomale dominante moștenite matern sau a mutațiilor cu secvență mare care includ duplicarea, extinderea sau inserarea secvențelor ADN este mai dificilă.

În ADNcff, fragmentele cu lungimea de 200 - 300 bp implicate în tulburările cu o singură genă sunt mai dificil de detectat.

De exemplu, starea autosomală dominantă, acondroplazia este cauzată de mutația punctului genei FGFR3. La două sarcini cu un făt cu acondroplazie a fost găsită o mutație G1138A moștenită paternal de la ADNcff dintr-o probă de plasmă maternă într-una și o mutație G1138A de novo din cealaltă.

În studiile de genetică a coreei Huntington folosind qRT-PCR de cffDNA din probe de plasmă maternă, repetările CAG au fost detectate la niveluri normale (17, 20 și 24).

cffDNA poate fi, de asemenea, utilizat pentru a diagnostica tulburări cu o singură genă . Dezvoltările proceselor de laborator care utilizează ADNc-cff pot permite diagnosticarea prenatală a aneuploidiilor, cum ar fi trisomia 21 (sindromul Down) la făt.

Boala hemolitică a fătului și a nou-născutului

Incompatibilitatea antigenelor RhD fetale și materne este principala cauză a bolii hemolitice la nou-născut . Aproximativ 15% dintre femeile caucaziene , 3-5% dintre femeile din Africa neagră și mai puțin de 3% dintre femeile asiatice sunt RhD negative.

Diagnosticul prenatal precis este important deoarece boala poate fi fatală pentru nou-născut și deoarece tratamentul care include imunoglobulină intramusculară (Anti-D) sau imunoglobulină intravenoasă poate fi administrat mamelor cu risc.

PCR pentru a detecta exonii genei RHD (gena) 5 și 7 din cffDNA obținut din plasma maternă între 9 și 13 săptămâni de gestație oferă un grad ridicat de specificitate, sensibilitate și precizie diagnostică (> 90%) în comparație cu determinarea RhD din serul de sânge din cordonul ombilical nou-născut . S-au obținut rezultate similare care vizează exonii 7 și 10. PCR digitală prin picurare în determinarea RhD fetală a fost comparabilă cu o tehnică de rutină PCR în timp real.

Determinarea de rutină a statusului RhD fetal din ADNcff în serul matern permite gestionarea timpurie a sarcinilor cu risc în timp ce scade utilizarea inutilă a Anti-D cu peste 25%.

Aneuploidie

Cromozomi sexuali

Analiza serului matern cffDNA prin high-secventiere poate detecta comune sexuale cromozomiale fetale aneuploidies , cum ar fi sindromul Turner , sindromul Klinefelter si sindromul triplu X , dar procedura de valoare predictivă pozitivă este scăzută.

Trisomia 21

Trisomia fetală a cromozomului 21 este cauza sindromului Down. Această trisomie poate fi detectată prin analiza cffDNA din sângele matern prin secvențierea masivă a puștii (MPSS). O altă tehnică este analiza digitală a regiunilor selectate (DANSR). Astfel de teste arată o sensibilitate de aproximativ 99% și o specificitate mai mare de 99,9%. Prin urmare, acestea nu pot fi considerate ca proceduri de diagnostic, dar pot fi utilizate pentru a confirma un test pozitiv de screening matern, cum ar fi un screening în primul trimestru sau markeri cu ultrasunete ai afecțiunii.

Trisomia 13 și 18

Este posibilă analiza cffDNA din plasma maternă cu MPSS în căutarea trisomiei 13 sau 18

Factorii care limitează sensibilitatea și specificitatea includ nivelurile de ADNcff în plasma maternă; cromozomii materni pot avea mozaicism .

Un număr de molecule de acid nucleic fetal derivate din cromozomii aneuploidieni pot fi detectate, inclusiv mRNA SERPINEB2, îmbrăcat B, SERPINB5 hipometilat din cromozomul 18, specific placentei 4 (PLAC4), holocarboxilază sintetază hipermetilată (HLCS) și c21orf105 mRNA din cromozomul 12. Cu complet trisomia, alelele ARNm din plasma maternă nu reprezintă raportul normal 1: 1, dar este de fapt 2: 1. Rapoartele alelice determinate de markeri epigenetici pot fi de asemenea folosite pentru a detecta trisomiile complete. Secvențierea paralelă masivă și PCR digitală pentru detectarea aneuploidiei fetale pot fi utilizate fără restricții la moleculele de acid nucleic specifice fetusului. (MPSS) se estimează că are o sensibilitate între 96 și 100% și o specificitate între 94 și 100% pentru detectarea sindromului Down. Poate fi efectuat la 10 săptămâni de vârstă gestațională . Un studiu din Statele Unite a estimat o rată fals pozitivă de 0,3% și o valoare predictivă pozitivă de 80% atunci când se utilizează cffDNA pentru a detecta sindromul Down.

Preeclampsie

Preeclampsia este o afecțiune complexă a sarcinii care implică hipertensiune și proteinurie, de obicei după 20 de săptămâni de gestație. Este asociat cu o invazie citotrofoblastică slabă a miometrului . Debutul afecțiunii între 20 și 34 de săptămâni de gestație este considerat „devreme”. Probele de plasmă maternă la sarcinile complicate de preeclampsie au niveluri semnificativ mai ridicate de cffDNA decât cele din sarcinile normale. Acest lucru este valabil pentru preeclampsia cu debut precoce.

Perspective de viitor

Secvențierea de nouă generație poate fi utilizată pentru a produce o întreagă secvență de genom din cffDNA. Acest lucru ridică întrebări etice. Cu toate acestea, utilitatea procedurii poate crește pe măsură ce se descoperă asocieri clare între variantele genetice specifice și stările de boală.

Vezi si

Referințe