Degradare Edman - Edman degradation
Degradarea Edman , dezvoltată de Pehr Edman , este o metodă de secvențiere a aminoacizilor într-o peptidă . În această metodă, reziduul amino-terminal este marcat și scindat din peptidă fără a perturba legăturile peptidice dintre alte resturi de aminoacizi.
Mecanism
Isotiocianatul de fenil reacționează cu o grupare amino N-terminală neîncărcată, în condiții ușor alcaline, pentru a forma un derivat ciclic de feniltiocarbamoil . Apoi, în condiții acide , acest derivat al aminoacidului terminal este scindat ca un derivat al tiazolinonei. Aminoacidul tiazolinonic este apoi extras selectiv într-un solvent organic și tratat cu acid pentru a forma feniltiohidantoina (PTH) - derivatul aminoacidului mai stabil care poate fi identificat prin utilizarea cromatografiei sau electroforezei . Această procedură poate fi apoi repetată din nou pentru a identifica următorul aminoacid. Un dezavantaj major al acestei tehnici este că peptidele care sunt secvențiate în acest mod nu pot avea mai mult de 50 până la 60 de reziduuri (și, în practică, sub 30). Lungimea peptidei este limitată din cauza derivatizării ciclice, care nu merge întotdeauna la finalizare. Problema derivatizării poate fi rezolvată prin scindarea peptidelor mari în peptide mai mici înainte de a continua cu reacția. Este capabil să secvențeze cu precizie până la 30 de aminoacizi cu mașini moderne capabile să aibă o eficiență de peste 99% per aminoacid . Un avantaj al degradării Edman este că folosește doar 10 - 100 pico-moli de peptidă pentru procesul de secvențiere. Reacția de degradare Edman a fost automatizată în 1967 de Edman și Beggs pentru a accelera procesul și 100 de dispozitive automatizate erau utilizate în întreaga lume până în 1973.
Limitări
Deoarece degradarea Edman are loc de la capătul N-terminal al proteinei, nu va funcționa dacă capătul N-terminal a fost modificat chimic (de exemplu, prin acetilare sau formarea acidului piroglutamic ). Secvențierea se va opri dacă se întâlnește un non-α-aminoacid (de exemplu acid izoaspartic ), deoarece intermediarul inelar cu cinci membri preferat nu poate fi format. Degradarea Edman nu este, în general, utilă pentru a determina pozițiile punților disulfură. De asemenea, necesită cantități de peptide de 1 picomol sau mai mult pentru rezultate discernabile.
Analiza cuplată
După 2D SDS PAGE proteinele pot fi transferate într-o membrană de șters de difluorură de poliviniliden (PVDF) pentru analiză ulterioară. Degradările Edman pot fi efectuate direct dintr-o membrană PVDF. Secvențierea reziduurilor N-terminale rezultând cinci până la zece aminoacizi poate fi suficientă pentru a identifica o proteină de interes (POI).