Gram color - Gram stain

O pată Gram de Staphylococcus aureus mixt ( S. aureus ATCC 25923, coci gram-pozitivi , în violet) și Escherichia coli ( E. coli ATCC 11775, bacili gram negativi, în roșu), cele mai frecvente bacterii de referință pentru colorarea Gram

Colorația Gram sau colorația Gram , numita metoda Gram , este o metodă de colorare cu utilizată pentru a distinge și clasifica bacteriene specii în două grupe mari: bacterii gram - pozitive și bacterii gram - negative . Numele vine de la bacteriologul danez Hans Christian Gram , care a dezvoltat tehnica.

Colorarea Gram diferențiază bacteriile prin proprietățile chimice și fizice ale pereților lor celulari . Celulele gram-pozitive au un strat gros de peptidoglican în peretele celular care păstrează pata primară, cristal violet . Celulele gram-negative au un strat de peptidoglican mai subțire care permite cristalului violet să se spele la adăugarea de etanol. Acestea sunt colorate în roz sau roșu de contracolor , de obicei safranină sau fucsină . Soluția de iod Lugol este adăugată întotdeauna după adăugarea cristalului violet pentru a întări legăturile petei cu membrana celulară. Colorarea Gram este aproape întotdeauna primul pas în identificarea preliminară a unui organism bacterian. În timp ce colorarea Gram este un instrument valoros de diagnostic atât în ​​setările clinice, cât și în cele de cercetare, nu toate bacteriile pot fi clasificate definitiv prin această tehnică. Acest lucru dă naștere la grupuri gram-variabile și gram-nedeterminate.

Istorie

Metoda poartă numele inventatorului său, omul de știință danez Hans Christian Gram (1853–1938), care a dezvoltat tehnica în timp ce lucra cu Carl Friedländer în morga spitalului orașului din Berlin în 1884. Gram a conceput tehnica sa nu în scopul distingând un tip de bacterie de altul, dar pentru a face bacteriile mai vizibile în secțiunile colorate ale țesutului pulmonar. El și-a publicat metoda în 1884 și a inclus în scurtul său raport observația că bacilul tifos nu a păstrat pata.

Utilizări

Pata Gram de Candida albicans dintr-un tampon vaginal. Micii clamidospori ovali au un diametru de 2–4 µm .

Colorarea Gram este o tehnică de laborator bacteriologică utilizată pentru a diferenția speciile bacteriene în două grupuri mari ( gram-pozitive și gram-negative ) pe baza proprietăților fizice ale pereților lor celulari . Colorarea Gram nu este utilizată pentru a clasifica archaea , anterior archaeabacteria, deoarece aceste microorganisme dau răspunsuri foarte variate, care nu urmăresc grupurile lor filogenetice .

Unele organisme sunt gram-variabile (ceea ce înseamnă că pot colora fie negativ, fie pozitiv); unele nu sunt colorate cu niciun colorant utilizat în tehnica Gram și nu sunt văzute. Într-un laborator modern de microbiologie de mediu sau moleculară, cea mai mare parte a identificării se face folosind secvențe genetice și alte tehnici moleculare, care sunt mult mai specifice și mai informative decât colorarea diferențială.

Medical

Petele Gram sunt efectuate pe lichidul corporal sau biopsie atunci când se suspectează infecția . Petele Gram dau rezultate mult mai repede decât cultivarea și sunt deosebit de importante atunci când infecția ar face o diferență importantă în tratamentul și prognosticul pacientului; exemple sunt lichidul cefalorahidian pentru meningită și lichidul sinovial pentru artrita septică .

Mecanism de colorare

Gram negativ colorat în violet (stânga) și gram negativ colorat în roz (dreapta)

Bacteriile gram-pozitive au un perete celular gros asemănător ochiurilor, realizat din peptidoglican (50-90% din învelișul celulei) și, ca rezultat, sunt colorate în violet de cristal, în timp ce bacteriile gram-negative au un strat mai subțire (10% din celulă) plic), deci nu rețineți pata purpurie și sunt contracolorate de roz de safranină. Există patru etape de bază ale petei Gram:

  • Aplicarea unei pete primare ( cristal violet ) pe un frotiu fixat termic al unei culturi bacteriene. Fixarea căldurii ucide unele bacterii, dar este folosită în principal pentru a fixa bacteriile pe lamă, astfel încât să nu se clătească în timpul procedurii de colorare.
  • Adăugarea de iod , care se leagă de cristalul violet și îl captează în celulă
  • Decolorare rapidă cu etanol sau acetonă
  • Counterstaining cu safranina . Carbol fuchsin este uneori înlocuit cu safranin, deoarece colorează mai intens bacteriile anaerobe, dar este mai puțin utilizat ca contrapătare.
Rezumatul petei Gram
Aplicarea Reactiv Culoarea celulei
Gram-pozitiv Gram negativ
Vopsea primară cristal violet Violet Violet
mordant iod Violet Violet
Decolorant alcool / acetonă Violet incolor
Contor pata safranin / carbol fuchsin Violet roz sau roșu

Violetul de cristal (CV) se disociază în soluții apoase în CV+
și clorură ( Cl-
) ioni. Acești ioni pătrund în peretele celular atât al celulelor gram-pozitive, cât și al celelor gram-negative. CV - ul+
ionul interacționează cu componentele încărcate negativ ale celulelor bacteriene și colorează celulele în violet.

Iodură ( I-
sau eu-
3
) interacționează cu CV+
și formează complexe mari de cristal violet și iod (CV – I) în straturile interioare și exterioare ale celulei. Iodul este adesea denumit mordant , dar este un agent de captare care împiedică îndepărtarea complexului CV – I și, prin urmare, colorează celula.

Când se adaugă un decolorant, cum ar fi alcoolul sau acetona, acesta interacționează cu lipidele membranei celulare. O celulă gram-negativă își pierde membrana lipopolizaharidică externă, iar stratul interior de peptidoglican este lăsat expus. Complexele CV – I sunt spălate din celula gram-negativă împreună cu membrana exterioară. În schimb, o celulă gram-pozitivă se deshidratează dintr-un tratament cu etanol. Complexele mari CV – I devin prinse în celula gram-pozitivă datorită naturii multistratificate a peptidoglicanului său. Etapa de decolorare este critică și trebuie temporizată corect; pata de cristal violet este îndepărtată atât din celulele gram-pozitive, cât și din cele negative dacă agentul decolorant este lăsat prea mult timp (o chestiune de secunde).

După decolorare, celula gram-pozitivă rămâne purpurie, iar celula gram-negativă își pierde culoarea mov. Contrafața, care este de obicei safranină încărcată pozitiv sau fucsină de bază, se aplică ultima pentru a da bacteriilor gram-negative decolorate o culoare roz sau roșie. Atât bacteriile gram-pozitive, cât și bacteriile gram-negative preiau contrapata. Cu toate acestea, contracurentul este nevăzut pe bacteriile gram-pozitive din cauza petei de culoare violet de culoare mai închisă.

Exemple

Bacterii gram-pozitive

Bacteriile gram-pozitive au, în general, o singură membrană ( monoderm ) înconjurată de un peptidoglican gros. Această regulă este urmată de două filuri: Firmicutes (cu excepția claselor Mollicutes și Negativicutes ) și Actinobacteria . În schimb, membrii Chloroflexi (bacterii verzi fără sulf) sunt monodermi, dar posedă un peptidoglican subțire sau absent (clasa Dehalococcoidetes ) și pot pata negativ, pozitiv sau nedeterminat; membrii Deinococcus-Thermus grup colorație pozitivă , dar sunt diderms cu un peptidoglican gros.

Din punct de vedere istoric , formele gram-pozitive alcătuiau filul Firmicutes , un nume folosit acum pentru cel mai mare grup. Include multe genuri bine cunoscute, cum ar fi Lactobacillus, Bacillus , Listeria , Staphylococcus , Streptococcus , Enterococcus și Clostridium . De asemenea, a fost extins pentru a include Mollicutes, bacterii precum Mycoplasma și Thermoplasma care nu au pereți celulari și, prin urmare, nu pot fi colorate Gram, dar sunt derivate din astfel de forme.

Unele bacterii au pereți celulari deosebit de pricepuți la reținerea petelor. Acestea vor părea pozitive prin colorarea Gram, chiar dacă nu sunt strâns legate de alte bacterii gram-pozitive. Acestea sunt numite bacterii cu aciditate rapidă și pot fi diferențiate de alte bacterii gram-pozitive numai prin proceduri speciale de colorare .

Bacterii gram-negative

Bacteriile gram-negative posedă în general un strat subțire de peptidoglican între două membrane ( diderm ). Lipopolizaharida (LPS) este cel mai abundent antigen de pe suprafața celulei a majorității bacteriilor Gram-negative, contribuind până la 80% din membrana exterioară a E. coli și Salmonella . Majoritatea filelor bacteriene sunt gram-negative, incluzând cianobacteriile , bacteriile cu sulf verde și cele mai multe proteobacterii (excepții fiind unii membri ai Rickettsiales și insectele-endosimbioni ai Enterobacteriales ).

Bacterii Gram-variabile și Gram-nedeterminate

Unele bacterii, după colorarea cu pata Gram, dau un model gram-variabil: se observă un amestec de celule roz și violet. În culturile de Bacillus, Butyrivibrio și Clostridium , o scădere a grosimii peptidoglicanului în timpul creșterii coincide cu o creștere a numărului de celule care colorează gram-negative. În plus, la toate bacteriile colorate folosind colorarea Gram, vârsta culturii poate influența rezultatele colorării.

Bacteriile Gram nedeterminate nu răspund previzibil la colorarea Gram și, prin urmare, nu pot fi determinate nici ca gram-pozitive, nici ca gram-negative. Exemplele includ multe specii de Mycobacterium , inclusiv Mycobacterium bovis , Mycobactrium leprae și Mycobacterium tuberculosis , dintre care ultimii doi sunt agenții cauzatori ai leprei și, respectiv, tuberculoza. Bacteriile din genul Mycoplasma nu au un perete celular în jurul membranelor celulare , ceea ce înseamnă că nu se colorează prin metoda lui Gram și sunt rezistente la antibioticele care vizează sinteza peretelui celular.

Notă ortografică

Termenul de colorare Gram este derivat din numele de familie al lui Hans Christian Gram ; eponim , prin urmare , (Gram) este capitalizat , dar nu substantivul comun (pata) , așa cum este de obicei pentru termeni științifici. Literele inițiale ale gram-pozitive și gram-negativ , care sunt adjective omonim , poate fi fie de capital G sau litere mici g , în funcție de ceea ce Ghid stilistic (dacă este cazul) reglementează documentul fiind scris. Stilul cu litere mici este folosit de Centrele SUA pentru Controlul și Prevenirea Bolilor și alte regimuri de stil, cum ar fi stilul AMA . Dicționarele pot folosi litere mici, majuscule sau ambele. Utilizarea majusculă Gram-pozitivă sau Gram-negativă este, de asemenea, obișnuită în multe articole și publicații de reviste științifice . Când articolele sunt trimise către jurnale, fiecare jurnal poate sau nu să aplice stilul casei versiunii postprint . Versiunile de preimprimare conțin orice stil a folosit autorul. Chiar și regimurile de stil care utilizează litere mici pentru adjectivele gram-pozitive și gram-negative utilizează în mod obișnuit majuscule pentru colorarea Gram .

Vezi si

Referințe

linkuri externe