Anticorp monoclonal - Monoclonal antibody

O reprezentare generală a metodei utilizate pentru a produce anticorpi monoclonali.

Un anticorp monoclonal ( mAb sau moAb ) este un anticorp produs prin clonarea unei celule albe unice din sânge . Toți anticorpii derivați astfel derivă înapoi la o celulă părinte unică.

Anticorpii monoclonali pot avea afinitate monovalentă, legându-se doar de același epitop (partea unui antigen recunoscută de anticorp). În contrast, anticorpii policlonali se leagă de epitopi multipli și sunt de obicei produși de mai mulți anticorpi care secretă linii de celule plasmatice . Anticorpii monoclonali bispecifici pot fi, de asemenea, proiectați, prin creșterea țintelor terapeutice ale unui anticorp monoclonal la doi epitopi.

Este posibil să se producă anticorpi monoclonali care se leagă în mod specific de practic orice substanță adecvată; pot servi apoi la detectarea sau purificarea acestuia. Această capacitate a devenit un instrument important în biochimie , biologie moleculară și medicină .

Istorie

La începutul anilor 1900, imunologul Paul Ehrlich a propus ideea unui Zauberkugel - „ glonț magic ”, conceput ca un compus care vizează în mod selectiv un organism cauzator de boli și care poate furniza o toxină pentru acel organism. Acest lucru a stat la baza conceptului de anticorpi monoclonali și conjugați de medicamente monoclonali. Ehrlich și Élie Metchnikoff au primit premiul Nobel pentru fiziologie sau medicină din 1908 pentru că au oferit baza teoretică pentru imunologie.

Prin 1970, limfocite care produc un anticorp unic au fost cunoscute, sub forma de mielom multiplu - un cancer care afecteaza celulele B . Acești anticorpi anormali sau paraproteine au fost folosiți pentru a studia structura anticorpilor, dar nu a fost încă posibil să se producă anticorpi identici specifici unui antigen dat . În 1973, Jerrold Schwaber a descris producția de anticorpi monoclonali folosind celule hibride om-șoarece. Această lucrare rămâne citată pe scară largă printre cei care utilizează hibridomi derivate de la om . În 1975, Georges Köhler și César Milstein au reușit să realizeze fuziuni de linii celulare de mielom cu celule B pentru a crea hibridomi care ar putea produce anticorpi, specifici antigenilor cunoscuți și care au fost imortalizați. Ei și Niels Kaj Jerne au împărțit Premiul Nobel pentru fiziologie sau medicină în 1984 pentru descoperire.

În 1988, Greg Winter și echipa sa au inițiat tehnicile de umanizare a anticorpilor monoclonali, eliminând reacțiile pe care mulți anticorpi monoclonali le-au provocat la unii pacienți. În anii 1990, cercetările făceau progrese în utilizarea terapeutică a anticorpilor monoclonali, iar în 2018, James P. Allison și Tasuku Honjo au primit Premiul Nobel pentru fiziologie sau medicină pentru descoperirea terapiei împotriva cancerului prin inhibarea reglării imune negative, folosind anticorpi monoclonali care previn legături inhibitorii.

Producție

Cercetătorii se uită la diapozitive de culturi de celule care produc anticorpi monoclonali. Acestea sunt cultivate într-un laborator și cercetătorii analizează produsele pentru a selecta cele mai promițătoare dintre ele.
Anticorpii monoclonali pot fi crescuți în cantități nelimitate în sticle precum cele prezentate în această imagine.
Tehnician umplând fântâni cu un lichid pentru un test de cercetare. Acest test implică pregătirea culturilor în care hibrizii sunt crescuți în cantități mari pentru a produce anticorpul dorit. Acest lucru se realizează prin fuzionarea unei celule de mielom și a unui limfocit de șoarece pentru a forma o celulă hibridă ( hibridom ).
Tehnicianul de laborator scăldând diapozitive pregătite într-o soluție. Acest tehnician pregătește diapozitive de anticorpi monoclonali pentru cercetători. Celulele prezentate etichetează cancerul de sân la om .

Dezvoltarea hibridomului

O mare parte a activității din spatele producției de anticorpi monoclonali este înrădăcinată în producerea de hibridomi, care implică identificarea celulelor plasmatice / plasmablast (ASPC) specifice antigenului care produc anticorpi specifici unui antigen de interes și fuzionarea acestor celule cu celulele mielomului . Celulele B de iepure pot fi utilizate pentru a forma un hibridom de iepure . Polietilen glicolul este folosit pentru a contopi membranele plasmatice adiacente, dar rata de succes este scăzută, astfel încât este utilizat un mediu selectiv în care numai celulele condensate pot crește. Acest lucru este posibil, deoarece celulele mielomului au pierdut capacitatea de a sintetiza hipoxantina-guanina-fosforibosil transferaza (HGPRT), o enzimă necesară pentru sinteza de recuperare a acizilor nucleici. Absența HGPRT nu este o problemă pentru aceste celule decât dacă calea de sinteză purină de novo este, de asemenea, perturbată. Expunerea celulelor la aminopterină (un analog al acidului folic , care inhibă dihidrofolatul reductazei , DHFR), le face incapabile să utilizeze calea de novo și să devină complet auxotrofe pentru acizii nucleici , necesitând astfel suplimentarea pentru a supraviețui.

Mediul de cultură selectiv se numește mediu HAT deoarece conține hipoxantină , aminopterină și timidină . Acest mediu este selectiv pentru celulele fuzionate ( hibridom ). Celulele de mielom nefuzate nu pot crește deoarece le lipsește HGPRT și, prin urmare, nu își pot reproduce ADN-ul. Celulele splinei nefuzionate nu pot crește la nesfârșit din cauza duratei lor de viață limitate. Doar celulele hibride condensate, denumite hibridom, sunt capabile să crească la nesfârșit în mediu, deoarece partenerul de celule splenice furnizează HGPRT, iar partenerul de mielom are trăsături care îl fac nemuritor (similar cu o celulă canceroasă).

Acest amestec de celule este apoi diluat și clonele sunt crescute din celule monoparentale pe godeuri de microtitrare. Anticorpii secretați de diferitele clone sunt apoi testați pentru capacitatea lor de a se lega de antigen (cu un test cum ar fi testul ELISA sau microorganismul antigenului) sau blot imunodot . Clona cea mai productivă și stabilă este apoi selectată pentru o utilizare viitoare.

Hibridomele pot fi cultivate la nesfârșit într-un mediu de cultură celulară adecvat. De asemenea, pot fi injectați la șoareci (în cavitatea peritoneală , înconjurând intestinul). Acolo, ele produc tumori care secretă un fluid bogat în anticorpi numit lichid de ascită .

Mediul trebuie îmbogățit în timpul selecției in vitro pentru a favoriza în continuare creșterea hibridomului. Acest lucru poate fi realizat prin utilizarea unui strat de celule fibrocite alimentatoare sau a unui mediu suplimentar, cum ar fi briclonă. Se pot utiliza medii de cultură condiționate de macrofage. Producția în cultura celulară este de obicei preferată, deoarece tehnica ascitei este dureroasă pentru animal. Acolo unde există tehnici alternative, ascita este considerată lipsită de etică .

Noua tehnologie de dezvoltare mAb

Recent, au fost dezvoltate mai multe tehnologii de anticorpi monoclonali, cum ar fi afișarea fagilor , cultura de celule B unice, amplificarea unei singure celule din diferite populații de celule B și tehnologii de interogare cu celule plasmatice unice. Spre deosebire de tehnologia tradițională a hibridomului, noile tehnologii utilizează tehnici de biologie moleculară pentru a amplifica lanțurile grele și ușoare ale genelor de anticorpi prin PCR și de a produce fie în sisteme bacteriene, fie în mamifere, cu tehnologie recombinantă . Unul dintre avantajele noilor tehnologii este aplicabil mai multor animale, cum ar fi iepurele, lama, puiul și alte animale comune experimentale din laborator.

Purificare

După obținerea fie a unei probe media de hibridomi de cultură, fie a unei probe de lichid de ascită, trebuie extrase anticorpii doriți. Contaminanții probei de cultură celulară constau în principal din componente media, cum ar fi factorii de creștere, hormoni și transferrine . În contrast, eșantionul in vivo este probabil să aibă anticorpi gazdă, proteaze , nucleaze , acizi nucleici și viruși . În ambele cazuri, pot fi prezente și alte secreții ale hibridomelor, cum ar fi citokinele . De asemenea, poate exista contaminare bacteriană și, ca urmare, endotoxine care sunt secretate de bacterii. În funcție de complexitatea mediului necesar în cultura celulară și, prin urmare, a contaminanților, poate fi preferabilă una sau alta metodă ( in vivo sau in vitro ).

Proba este condiționată mai întâi sau preparată pentru purificare. Celulele, resturile celulare, lipidele și materialul coagulat sunt mai întâi îndepărtate, de obicei prin centrifugare urmată de filtrare cu un filtru de 0,45 µm. Aceste particule mari pot provoca un fenomen numit murdărie de membrană în etapele ulterioare de purificare. În plus, concentrația produsului din probă poate să nu fie suficientă, mai ales în cazurile în care anticorpul dorit este produs de o linie celulară cu secretie scăzută. Prin urmare, proba este concentrată prin ultrafiltrare sau dializă .

Majoritatea impurităților încărcate sunt de obicei anioni, cum ar fi acizii nucleici și endotoxinele. Acestea pot fi separate prin cromatografie cu schimb de ioni . Fie cromatografia cu schimb de cationi este utilizată la un pH suficient de mic încât anticorpul dorit se leagă de coloană în timp ce anionii curg, fie cromatografia cu schimb de anioni este utilizată la un pH suficient de mare încât anticorpul dorit să curgă prin coloană în timp ce anionii se leagă de aceasta. Diferite proteine ​​pot fi, de asemenea, separate împreună cu anionii pe baza punctului lor izoelectric (pI). În proteine, punctul izoelectric (pI) este definit ca pH-ul la care o proteină nu are sarcină netă. Când pH-ul> pI, o proteină are o sarcină netă negativă, iar când pH-ul <pI, o proteină are o sarcină netă pozitivă. De exemplu, albumina are un pI de 4,8, care este semnificativ mai mic decât cel al majorității anticorpilor monoclonali, care au un pI de 6,1. Astfel, la un pH cuprins între 4,8 și 6,1, sarcina medie a moleculelor de albumină este probabil mai negativă, în timp ce moleculele mAbs sunt încărcate pozitiv și, prin urmare, este posibil să le separe. Transferrina, pe de altă parte, are un pI de 5,9, deci nu poate fi ușor separat prin această metodă. O diferență de pI de cel puțin 1 este necesară pentru o bună separare.

Transferrina poate fi în schimb eliminată prin cromatografie de excludere a dimensiunii . Această metodă este una dintre cele mai fiabile tehnici de cromatografie. Deoarece avem de-a face cu proteine, proprietăți precum încărcarea și afinitatea nu sunt consistente și variază în funcție de pH, deoarece moleculele sunt protonate și deprotonate, în timp ce dimensiunea rămâne relativ constantă. Cu toate acestea, are dezavantaje, cum ar fi rezoluția scăzută, capacitatea redusă și timpi de eluție scăzute .

O mult mai rapidă, metoda singură etapă de separare este proteina A / G cromatografia de afinitate . Anticorpul se leagă selectiv de proteina A / G, deci se obține un nivel ridicat de puritate (în general> 80%). Cu toate acestea, această metodă poate fi problematică pentru anticorpii care sunt ușor deteriorați, deoarece sunt utilizate în general condiții dure. Un pH scăzut poate rupe legăturile pentru a îndepărta anticorpul din coloană. Pe lângă faptul că poate afecta produsul, pH-ul scăzut poate provoca scurgerea proteinei A / G de pe coloană și să apară în proba eluată. Sunt disponibile sisteme tampon de eluție ușoare care utilizează concentrații mari de sare pentru a evita expunerea anticorpilor sensibili la pH scăzut. Costul este, de asemenea, un aspect important cu această metodă, deoarece proteina A / G imobilizată este o rășină mai scumpă.

Pentru a atinge puritatea maximă într-o singură etapă, se poate efectua purificarea prin afinitate, folosind antigenul pentru a oferi specificitate pentru anticorp. În această metodă, antigenul utilizat pentru a genera anticorpul este atașat covalent la un suport de agaroză . Dacă antigenul este o peptidă , este sintetizat în mod obișnuit cu o cisteină terminală , care permite atașarea selectivă la o proteină purtătoare, cum ar fi KLH în timpul dezvoltării și pentru a sprijini purificarea. Mediul care conține anticorp este apoi incubat cu antigenul imobilizat, fie în lot, fie pe măsură ce anticorpul este trecut printr-o coloană, unde se leagă selectiv și poate fi reținut în timp ce impuritățile sunt spălate. O eluție cu un tampon cu pH scăzut sau un tampon de eluție mai delicat, mai mare cu sare este apoi utilizată pentru a recupera anticorpul purificat de pe suport.

Heterogenitatea anticorpilor

Eterogenitatea produsului este comună în anticorpii monoclonali și alte produse biologice recombinante și este de obicei introdusă fie în amonte în timpul exprimării, fie în aval în timpul fabricației.

Aceste variante sunt în mod tipic agregate, produse de deamidare , variante de glicozilare , lanțuri laterale de aminoacizi oxidate, precum și adăugări de aminoacizi amino și carboxil terminali. Aceste modificări structurale aparent minuscule pot afecta stabilitatea preclinică și optimizarea proceselor, precum și potența produsului terapeutic, biodisponibilitatea și imunogenitatea . Metoda general acceptată de purificare a fluxurilor de proces pentru anticorpii monoclonali include captarea produsului țintă cu proteina A , eluare, acidificare pentru a inactiva potențiali viruși de mamifere, urmată de cromatografie ionică , mai întâi cu bile anionice și apoi cu bile cationice.

Cromatografia cu deplasare a fost utilizată pentru a identifica și caracteriza aceste variante adesea nevăzute în cantități care sunt adecvate pentru regimurile de evaluare preclinice ulterioare, cum ar fi studiile farmacocinetice pe animale . Cunoștințele acumulate în faza de dezvoltare preclinică sunt esențiale pentru o mai bună înțelegere a calității produselor și oferă o bază pentru gestionarea riscurilor și o flexibilitate reglementară sporită. Inițiativa recentă a calității prin proiect a Food and Drug Administration, recentă, încearcă să ofere îndrumări cu privire la dezvoltare și să faciliteze proiectarea produselor și proceselor care maximizează profilul de eficacitate și siguranță, sporind în același timp fabricabilitatea produselor.

Recombinant

Producerea de anticorpi monoclonali recombinați implică clonarea repertoriului , CRISPR / Cas9 sau tehnologii de afișare a fagilor / afișare a drojdiei . Ingineria anticorpilor recombinați implică producerea de anticorpi prin utilizarea virușilor sau a drojdiei , mai degrabă decât a șoarecilor. Aceste tehnici se bazează pe donarea rapidă a segmentelor genei de imunoglobulină pentru a crea biblioteci de anticorpi cu secvențe de aminoacizi ușor diferite din care pot fi selectați anticorpi cu specificitățile dorite. Bibliotecile de anticorpi fagici sunt o variantă a bibliotecilor de antigeni fagici. Aceste tehnici pot fi utilizate pentru a spori specificitatea cu care anticorpii recunosc antigenii, stabilitatea lor în diferite condiții de mediu, eficacitatea lor terapeutică și detectabilitatea lor în aplicații diagnostice. Camerele de fermentare au fost utilizate pentru producerea de anticorpi pe scară largă.

Anticorpi chimerici

În timp ce anticorpii șoareci și umani sunt similari din punct de vedere structural, diferențele dintre aceștia au fost suficiente pentru a invoca un răspuns imun atunci când anticorpii monoclonali murini au fost injectați la om, ducând la îndepărtarea rapidă a acestora din sânge, precum și la efecte inflamatorii sistemice și la producerea de anti- anticorpi de șoarece (HAMA).

ADN-ul recombinant a fost explorat de la sfârșitul anilor 1980 pentru a crește timpul de ședere. Într-o abordare, ADN-ul șoarecului care codifică porțiunea de legare a unui anticorp monoclonal a fost fuzionat cu ADN-ul producător de anticorpi umani în celulele vii. Expresia acestui ADN „ himeric ” sau „umanizat” prin cultură celulară a dat anticorpi parțial șoareci, parțial umani.

Anticorpi umani

S-au dezvoltat abordări pentru izolarea anticorpilor monoclonali umani

Încă de la descoperirea că ar putea fi generați anticorpi monoclonali, oamenii de știință au vizat crearea de produse pe deplin umane pentru a reduce efectele secundare ale anticorpilor umanizați sau himerici. Au fost identificate mai multe abordări de succes: șoareci transgenici , afișarea fagilor și clonarea cu celule B unice:

În noiembrie 2016, treisprezece dintre cele nouăsprezece medicamente cu anticorpi monoclonali complet umani de pe piață au fost derivate din tehnologia șoarecilor transgenici.

Organizațiile care adoptă piața tehnologiei transgenice includ:

  • Abgenix - care a comercializat tehnologia Xenomouse. Abgenix a fost achiziționat în aprilie 2006 de Amgen .
  • Tehnologia Regeneron Pharmaceuticals VelocImmune.
  • Kymab - care își comercializează tehnologia Kymouse.
  • Deschideți platforma OmniRat ™ și OmniMouse ™ a Monoclonal Technology.
  • TRIANNI, Inc. - care își comercializează platforma de mouse TRIANNI .
  • Ablexis, LLC - care își comercializează platforma AlivaMab Mouse.

Afișarea fagilor poate fi utilizată pentru a exprima domenii variabile de anticorpi pe proteinele de înveliș fagos filamentos ( proteina de înveliș major fag ). Acești anticorpi cu afișare de fagi pot fi utilizați pentru diverse aplicații de cercetare. ProAb a fost anunțat în decembrie 1997 și a implicat screening-ul de mare randament al bibliotecilor de anticorpi împotriva țesutului bolnav și ne-bolnav, în timp ce Proximol a folosit o reacție enzimatică cu radicali liberi pentru a marca moleculele în apropierea unei proteine ​​date.

Anticorpii monoclonali au fost aprobați pentru a trata cancerul , bolile cardiovasculare , bolile inflamatorii , degenerescența maculară , respingerea transplantului , scleroza multiplă și infecția virală .

În august 2006, cercetătorii farmaceutici și producătorii din America au raportat că companiile americane au 160 de anticorpi monoclonali diferiți în studiile clinice sau în așteptarea aprobării de către Food and Drug Administration .

Cost

Anticorpii monoclonali sunt mai scumpi de fabricat decât moleculele mici datorită proceselor complexe implicate și dimensiunii generale a moleculelor, toate pe lângă costurile enorme de cercetare și dezvoltare implicate în aducerea unei noi entități chimice pacienților. Acestea sunt la prețuri pentru a permite producătorilor să recupereze costurile de investiții de obicei mari, iar acolo unde nu există controale de preț, cum ar fi Statele Unite, prețurile pot fi mai mari dacă oferă o mare valoare. Șapte cercetători de la Universitatea din Pittsburgh au concluzionat: „Prețul anual al terapiilor cu mAb este cu aproximativ 100.000 USD mai mare în oncologie și hematologie decât în ​​alte state de boală”, comparându-le pe bază de pacient, cu cele pentru tulburări cardiovasculare sau metabolice, imunologie, boli infecțioase, alergie și oftalmologie.

Aplicații

Testele de diagnostic

Odată ce anticorpii monoclonali pentru o anumită substanță au fost produși, aceștia pot fi utilizați pentru a detecta prezența acestei substanțe. Proteinele pot fi detectate folosind testele Western blot și imuno dot blot . În imunohistochimie , anticorpii monoclonali pot fi utilizați pentru a detecta antigeni în secțiuni fixe de țesut și, în mod similar, imunofluorescența poate fi utilizată pentru a detecta o substanță fie în secțiunea de țesut înghețat, fie în celulele vii.

Utilizări analitice și chimice

Anticorpii pot fi folosiți și pentru a purifica compușii țintă din amestecuri, folosind metoda imunoprecipitării .

Utilizări terapeutice

Anticorpii monoclonali terapeutici acționează prin mecanisme multiple, cum ar fi blocarea funcțiilor moleculei țintite, inducerea apoptozei în celulele care exprimă ținta sau prin modularea căilor de semnalizare.

Tratament pentru cancer

Un posibil tratament pentru cancer implică anticorpi monoclonali care se leagă doar de antigenii specifici celulelor canceroase și induc un răspuns imun împotriva celulei țintă canceroase. Astfel de mAb pot fi modificați pentru eliberarea unei toxine , radioizotop , citokină sau alt conjugat activ sau pentru a proiecta anticorpi bispecifici care se pot lega cu regiunile lor Fab atât la antigenul țintă, cât și la un conjugat sau celulă efectoare. Fiecare anticorp intact se poate lega de receptorii celulari sau alte proteine ​​cu regiunea sa Fc .

Anticorpi monoclonali pentru cancer. ADEPT , terapie cu promedicament enzimatic dirijat de anticorpi; ADCC : citotoxicitate mediată de celule dependentă de anticorpi; CDC: citotoxicitate dependentă de complement ; MAb: anticorp monoclonal; scFv, fragment Fv cu un singur lanț.

MAbs aprobate de FDA pentru cancer includ:

Boală autoimună

Anticorpii monoclonali utilizați pentru bolile autoimune includ infliximab și adalimumab , care sunt eficienți în artrita reumatoidă , boala Crohn , colita ulcerativă și spondilita anchilozantă prin capacitatea lor de a se lega și de a inhiba TNF-α . Basiliximab și daclizumab inhibă IL-2 pe celulele T activate și astfel ajută la prevenirea respingerii acute a transplanturilor de rinichi. Omalizumab inhibă imunoglobulina umană E (IgE) și este util în tratamentul astmului alergic moderat până la sever .

Exemple de anticorpi monoclonali terapeutici

Anticorpii monoclonali pentru aplicații de cercetare pot fi găsiți direct de la furnizorii de anticorpi sau prin utilizarea unui motor de căutare specializat precum CiteAb . Mai jos sunt exemple de anticorpi monoclonali importanți clinic.

Categoria principală Tip Cerere Mecanism / țintă Mod
anti -
inflamator
infliximab inhibă TNF-α himeric
adalimumab inhibă TNF-α uman
ustekinumab blochează interleucina IL-12 și IL-23 uman
basiliximab inhibă IL-2 pe celulele T activate himeric
daclizumab inhibă IL-2 pe celulele T activate umanizat
omalizumab
  • astm alergic moderat până la sever
inhibă imunoglobulina umană E (IgE) umanizat
Anti-cancer gemtuzumab vizează antigenul CD33 al suprafeței celulelor mieloide pe celulele leucemice umanizat
alemtuzumab vizează un antigen CD52 pe limfocitele T și B umanizat
rituximab vizează fosfoproteina CD20 pe limfocitele B. himeric
trastuzumab vizează receptorul HER2 / neu (erbB2) umanizat
nimotuzumab Inhibitor EGFR umanizat
cetuximab Inhibitor EGFR himeric
bevacizumab & ranibizumab inhibă VEGF umanizat
Anticancer și antiviral bavituximab imunoterapia , vizează fosfatidilserina himeric
Antiviral

casirivimab / imdevimab

imunoterapia , vizează proteina spike a SARS-CoV-2 himeric
bamlanivimab / etesevimab imunoterapia , vizează proteina spike a SARS-CoV-2 himeric
Alte palivizumab
  • Infecții cu VRS la copii
inhibă o proteină de fuziune RSV (F) umanizat
abciximab inhibă receptorul GpIIb / IIIa pe trombocite himeric

Efecte secundare

Mai mulți anticorpi monoclonali, cum ar fi bevacizumab și cetuximab , pot provoca diferite tipuri de efecte secundare. Aceste reacții adverse pot fi clasificate în reacții adverse frecvente și grave.

Unele reacții adverse frecvente includ:

  • Ameţeală
  • Dureri de cap
  • Alergii
  • Diaree
  • Tuse
  • Febră
  • Mâncărime
  • Dureri de spate
  • Slăbiciune generală
  • Pierderea poftei de mâncare
  • Insomnie
  • Constipație

Printre posibilele reacții adverse grave se numără:

Vezi si

Referințe

Lecturi suplimentare

linkuri externe