Mouse knockout - Knockout mouse

Un șoarece knockout , sau șoarece knock-out , este un șoarece modificat genetic ( Mus musculus ) în care cercetătorii au inactivat, sau „ knock-out ”, o genă existentă prin înlocuirea acesteia sau întreruperea acesteia cu o bucată artificială de ADN . Acestea sunt modele animale importante pentru studierea rolului genelor care au fost secvențiate, dar ale căror funcții nu au fost determinate. Făcând o anumită genă să fie inactivă la șoarece și observând orice diferență față de comportamentul sau fiziologia normală, cercetătorii pot deduce funcția sa probabilă.

Șoarecii sunt în prezent speciile de animale de laborator cele mai strâns legate de oameni pentru care tehnica knockout-ului poate fi aplicată cu ușurință. Acestea sunt utilizate pe scară largă în experimentele knock-out, în special cele care investighează probleme genetice care se referă la fiziologia umană . Eliminarea genetică la șobolani este mult mai dificilă și a fost posibilă abia din 2003.

Primul mouse-ul knockout înregistrat a fost creat de Mario R. Capecchi , Martin Evans și Oliver Smithies în 1989, pentru care au primit Premiul Nobel pentru fiziologie sau medicină din 2007 . Aspecte ale tehnologiei de generare a șoarecilor knockout și șoarecii înșiși au fost brevetate în multe țări de companii private.

Utilizare

Un șoarece de laborator în care o genă care afectează creșterea părului a fost eliminată (stânga), este prezentată lângă un șoarece de laborator normal.

Eliminarea activității unei gene oferă informații despre ceea ce face în mod normal acea genă. Oamenii împărtășesc multe gene cu șoareci. În consecință, observarea caracteristicilor șoarecilor knockout oferă cercetătorilor informații care pot fi folosite pentru a înțelege mai bine cum o genă similară poate provoca sau contribui la boli la om.

Exemple de cercetări în care șoarecii knockout au fost utili includ studierea și modelarea diferitelor tipuri de cancer , obezitate , boli de inimă , diabet , artrită , abuz de substanțe , anxietate , îmbătrânire și boala Parkinson . Șoarecii knockout oferă, de asemenea, un context biologic și științific în care medicamentele și alte terapii pot fi dezvoltate și testate.

Milioane de șoareci knockout sunt folosiți în experimente în fiecare an.

Tulpini

Un șoarece knockout (stânga) care este un model pentru obezitate, comparativ cu un șoarece normal.

Există câteva mii de tulpini diferite de șoareci knockout. Multe modele de șoareci poartă numele genei care a fost inactivată. De exemplu, șoarecele knockout p53 poartă numele genei p53 care codifică o proteină care în mod normal suprimă creșterea tumorilor prin oprirea diviziunii celulare și / sau inducerea apoptozei. Oamenii născuți cu mutații care dezactivează gena p53 suferă de sindromul Li-Fraumeni , o afecțiune care crește dramatic riscul de a dezvolta cancer de os, cancer de sân și cancer de sânge la o vârstă fragedă. Alte modele de șoarece sunt denumite în funcție de caracteristicile lor fizice sau de comportamente.

Procedură

Procedura de realizare a blastocistului cu genotip mixt.
Schema de reproducere pentru producerea șoarecilor knockout. Blastocisturile care conțin celule, care sunt atât tip sălbatic, cât și celule knockout, sunt injectate în uterul unei mame adoptive. Acest lucru produce descendenți care sunt fie de tip sălbatic și colorat de aceeași culoare ca donatorul de blastocist (gri) sau himeră (mixt) și parțial bătut. Șoarecii himerei sunt încrucișați cu un șoarece normal de tip sălbatic (gri). Aceasta produce descendenți albi sau heterozigoți pentru gena eliminată sau gri și sălbatic. Șoarecii heterozigoți albi pot fi ulterior încrucișați pentru a produce șoareci homozigoti pentru gena eliminată.

Există mai multe variante ale procedurii de producere a șoarecilor knockout; următorul este un exemplu tipic.

  1. Gena care trebuie eliminată este izolată dintr-o bibliotecă genică a șoarecilor . Apoi, este creată o nouă secvență de ADN , care este foarte asemănătoare cu gena originală și cu secvența vecină imediată, cu excepția faptului că este modificată suficient pentru a face gena inoperabilă. De obicei, noii secvențe primește și o genă marker , o genă pe care șoarecii normali nu o au și care conferă rezistență unui anumit agent toxic (de exemplu, neomicină) sau care produce o schimbare observabilă (de exemplu, culoare sau fluorescență). În plus, o a doua genă, cum ar fi herpes tk +, este, de asemenea, inclusă în construcție pentru a realiza o selecție completă.
  2. Celulele stem embrionare sunt izolate dintr-un blastocist de șoarece (un embrion foarte tânăr ) și cresc în vitro . Pentru acest exemplu, vom lua celule stem de la un șoarece alb.
  3. Noua secvență din etapa 1 este introdusă în celulele stem din etapa 2 prin electroporare . Prin procesul natural de recombinare omologă, unele dintre celulele stem electroporate vor încorpora noua secvență cu gena eliminată în cromozomii lor în locul genei originale. Șansele unui eveniment de recombinare reușit sunt relativ mici, astfel încât majoritatea celulelor modificate vor avea noua secvență doar într-unul din cei doi cromozomi relevanți - se spune că sunt heterozigoți . Celulele care au fost transformate cu un vector care conține gena de rezistență la neomicină și gena de herpes tk + sunt crescute într-o soluție care conține neomicină și Ganciclovir pentru a selecta transformările care au avut loc prin recombinare omoloagă. Orice inserție de ADN care a avut loc prin inserție aleatorie va muri deoarece testează pozitiv atât gena de rezistență la neomicină, cât și gena herpes tk +, al cărei produs genic reacționează cu Ganciclovir pentru a produce o toxină mortală. Mai mult, celulele care nu integrează niciun material genetic testează negativ pentru ambele gene și deci mor ca urmare a otrăvirii cu neomicină.
  4. Celulele stem embrionare care au încorporat gena eliminată sunt izolate din celulele nealterate folosind gena marker din etapa 1. De exemplu, celulele nealterate pot fi ucise folosind un agent toxic la care celulele modificate sunt rezistente.
  5. Celulele stem embrionare scoase din etapa 4 sunt introduse într-un blastocist de șoarece . Pentru acest exemplu, folosim blastocisti de la un mouse gri. Blastocisturile conțin acum două tipuri de celule stem: cele originale (de la șoarecele gri) și celulele knock-out (de la șoarecele alb). Acești blastocisti sunt apoi implantați în uterul șoarecilor femele, unde se dezvoltă. Șoarecii nou-născuți vor fi deci himere : unele părți ale corpului lor rezultă din celulele stem originale, alte părți din celulele stem knock-out. Blana lor va prezenta pete de alb și gri, cu pete albe derivate din celulele stem knock-out și pete gri de la blastocistul primitor.
  6. Unii dintre șoarecii himerei nou-născuți vor avea gonade derivate din celule stem knock-out și, prin urmare, vor produce ouă sau spermă care conțin gena knock-out. Când acești șoareci de himeră sunt încrucișați cu alții de tip sălbatic, unii dintre descendenții lor vor avea o copie a genei knock-out în toate celulele lor. Acești șoareci nu rețin ADN-ul șoarece gri și nu sunt himere, totuși sunt încă heterozigoți.
  7. Când acești descendenți heterozigoți sunt încrucișați, unii dintre descendenții lor vor moșteni gena eliminată de la ambii părinți; nu poartă nicio copie funcțională a genei originale nealterate (adică sunt homozigote pentru acea alelă).

O explicație detaliată a modului în care sunt creați șoareci knockout (KO) se află pe site-ul web al Premiului Nobel pentru fiziologie sau medicină 2007.

Limitări

Institutele Naționale de Sănătate discută câteva limitări importante ale acestei tehnici.

În timp ce tehnologia mouse-ului knockout reprezintă un instrument valoros de cercetare, există câteva limitări importante. Aproximativ 15% din eliminările genetice sunt letale din punct de vedere al dezvoltării, ceea ce înseamnă că embrionii modificați genetic nu pot crește în șoareci adulți. Această problemă este adesea depășită prin utilizarea mutațiilor condiționale . Lipsa șoarecilor adulți limitează studiile la dezvoltarea embrionară și adesea face mai dificilă determinarea funcției unei gene în raport cu sănătatea umană . În unele cazuri, gena poate îndeplini o funcție diferită la adulți decât la dezvoltarea embrionilor.

Eliminarea unei gene poate, de asemenea, să nu producă o schimbare observabilă la un șoarece sau poate produce chiar și caracteristici diferite de cele observate la oameni la care aceeași genă este inactivată. De exemplu, mutațiile genei p53 sunt asociate cu mai mult de jumătate din cancerele umane și duc adesea la tumori într-un anumit set de țesuturi. Cu toate acestea, atunci când gena p53 este eliminată la șoareci, animalele dezvoltă tumori într-o gamă diferită de țesuturi.

Există variabilitate în întreaga procedură, în funcție în mare măsură de tulpina din care au fost derivate celulele stem. În general se utilizează celule derivate din tulpina 129. Această tulpină specifică nu este potrivită pentru multe experimente (de exemplu, comportamentale), deci este foarte obișnuit să încrucișăm descendenții cu alte tulpini. Unii loci genomici s-au dovedit foarte dificil de eliminat. Motivele ar putea fi prezența secvențelor repetitive, metilarea extinsă a ADN-ului sau heterocromatina . Prezența confuză a 129 de gene învecinate pe segmentul knockout al materialului genetic a fost denumită „efectul genei de flancare”. Au fost propuse metode și linii directoare pentru a rezolva această problemă.

O altă limitare este că șoarecii knockout convenționali (adică necondiționați) se dezvoltă în absența genei care este investigată. Uneori, pierderea activității în timpul dezvoltării poate masca rolul genei în starea adultă, mai ales dacă gena este implicată în numeroase procese care acoperă dezvoltarea. Sunt necesare apoi abordări de mutație condiționată / inductibilă care permit mai întâi șoarecelui să se dezvolte și să se maturizeze normal înainte de ablația genei de interes.

O altă limitare serioasă este lipsa de adaptări evolutive în modelul knockout care ar putea apărea la animalele de tip sălbatic după ce acestea mută în mod natural. De exemplu, coexpression-eritrocit specifică GLUT1 cu stomatin constituie un mecanism de compensare la mamifere care nu sunt capabile de a sintetiza vitamina C .

Vezi si

Referințe

linkuri externe