Luciferaza - Luciferase

Domeniu catalitic dinoflagelat Luciferază
structura cristalină a unui domeniu luciferază din dinoflagelatul Lingulodinium polyedrum
Identificatori
Simbol	Luciferase_cat
Pfam	PF10285
InterPro	IPR018804
Structuri proteice disponibile: Pfam   structuri / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum rezumatul structurii

Luciferaza este un termen generic pentru clasa enzimelor oxidative care produc bioluminiscență și, de obicei, se distinge de o fotoproteină . Numele a fost folosit pentru prima dată de Raphaël Dubois, care a inventat cuvintele luciferină și luciferază, respectiv pentru enzimă și enzimă . Ambele cuvinte sunt derivate din cuvântul latin lucifer , care înseamnă „purtător de lumină”, care la rândul său este derivat din cuvintele latine pentru „lumină” ( lux) și „a aduce sau a purta” ( ferre) .

Luciferaza licurică
Structura luciferazei de licurici Photinus pyralis .
Identificatori
Organism	Photinus pyralis
Simbol	Luciferaza licurică
PDB	1LCI Mai multe structuri
UniProt	P08659
Alte date
Numărul CE	1.13.12.7
Caută Structuri Model elvețian Domenii InterPro

Luciferazele sunt utilizate pe scară largă în biotehnologie , pentru microscopie și ca gene raportoare , pentru multe dintre aceleași aplicații ca proteinele fluorescente . Cu toate acestea, spre deosebire de proteinele fluorescente, luciferazele nu necesită o sursă de lumină externă , dar necesită adăugarea de luciferină , substratul consumabil.

Exemple

O varietate de organisme își reglează producția de lumină folosind diferite luciferaze într-o varietate de reacții care emit lumină. Majoritatea luciferazelor studiate au fost găsite la animale, inclusiv licuricii și la multe animale marine, cum ar fi copepodele , meduzele și panselita de mare . Cu toate acestea, luciferazele au fost studiate în ciuperci luminoase, cum ar fi ciuperca Jack-O-Lantern , precum și exemple în alte regate, inclusiv bacterii luminoase și dinoflagelate .

Firefly și faceți clic pe gândac

Cele luciferazele de licurici - din care există peste 2000 de specii - și pe de altă elateroidea (click gândaci și rude în general) sunt suficient de diverse pentru a fi utili în filogenia moleculară . La licurici, oxigenul necesar este furnizat printr-un tub din abdomen numit traheea abdominală . O luciferază bine studiată este cea a licuriciului Photinini Photinus pyralis , care are un pH optim de 7,8.

Panselita de mare

De asemenea, este bine studiată panselita de mare , Renilla reniformis . În acest organism, luciferaza ( Renilla-luciferin 2-monooxigenaza ) este strâns asociată cu o proteină de legare a luciferinei, precum și cu o proteină fluorescentă verde ( GFP ). Calciul declanșează eliberarea de luciferină ( celenterazină ) din proteina de legare a luciferinei. Substratul este apoi disponibil pentru oxidare de către luciferază, unde este degradat în celenteramidă cu o eliberare de energie rezultată. În absența GFP, această energie ar fi eliberată ca un foton de lumină albastră (lungimea de undă de vârf de emisie 482 nm). Cu toate acestea, datorită GFP strâns asociat, energia eliberată de luciferază este cuplată în schimb prin transferul de energie de rezonanță la fluoroforul GFP și, ulterior, este eliberată ca un foton de lumină verde (lungimea de undă de vârf de emisie 510 nm). Reacția catalizată este:

• celenterazină + O ₂ → celenteramidă + CO ₂ + foton de lumină

Copepod

Au fost identificate recent luciferaze mai noi care, spre deosebire de alte luciferaze, sunt molecule secretate în mod natural. Un astfel de exemplu este luciferaza dependentă de Metridia coelenterazină (MetLuc, A0A1L6CBM1 ) care este derivată din copepodul marin Metridia longa . Metridia longa genei luciferază secretat codifică o proteină de 24 kDa ce conține o grupare N-terminală de semnal secretor peptidă din 17 aminoacizi resturile. Sensibilitatea și intensitatea ridicată a semnalului acestei molecule de luciferază se dovedește avantajoasă în multe studii de reporteri. Unele dintre beneficiile utilizării unei molecule de reporter secretate, cum ar fi MetLuc, este protocolul său de non-liză care permite să poată efectua teste de celule vii și teste multiple pe aceeași celulă.

Bacterian

Bioluminiscența bacteriană este văzută la speciile Photobacterium, Vibrio fischeri , Vibrio haweyi și Vibrio harveyi . Emisia de lumină în unele bacterii bioluminescente utilizează „antenă”, cum ar fi proteina lumazină , pentru a accepta energia din starea primară excitată pe luciferază, rezultând un cromofor lulnazinic excitat care emite lumină cu o lungime de undă mai mică (mai albastră), în timp ce în altele utilizați o proteină fluorescentă galbenă (YFP) cu FMN ca cromofor și emite lumină care este schimbată în roșu față de cea de la luciferază.

Dinoflagelat

Luciferaza dinoflagelată este o proteină eucariotă cu mai multe domenii , constând dintr-un domeniu N-terminal și din trei domenii catalitice , fiecare dintre ele precedat de un domeniu de fascicul elicoidal. Structura de dinoflagelate luciferază catalitic domeniu a fost rezolvată. Partea centrală a domeniului este un butoi beta cu 10 fire, care este similar din punct de vedere structural cu lipocalinele și FABP . Domeniul N-terminal este conservat între luciferaza dinoflagelată și proteinele de legare la luciferină (LBP). S-a sugerat că această regiune poate media o interacțiune între LBP și luciferază sau asocierea lor cu membrana vacuolară . Domeniul elicoidal pachet are trei pachet spirală structură care deține patru importante histidine care se crede ca joaca un rol in pH - ul reglarea enzimei . Există un buzunar mare în butoiul β al luciferazei dinoflagelate la pH 8 pentru a găzdui substratul de tetrapirol , dar nu există o deschidere care să permită pătrunderea substratului. Prin urmare, trebuie să apară o schimbare conformațională semnificativă pentru a oferi acces și spațiu pentru un ligand în situsul activ, iar sursa pentru această modificare este prin cele patru resturi de histidină N-terminale. La pH 8, se poate observa că resturile de histidină neprotonate sunt implicate într-o rețea de legături de hidrogen la interfața helicilor din pachet care blochează accesul substratului la locul activ și întreruperea acestei interacțiuni prin protonație (la pH 6,3) sau prin înlocuirea reziduurilor de histidină cu alanină determină o mișcare moleculară mare a fasciculului, separând helicile cu 11Å și deschizând situl catalitic. În mod logic, reziduurile de histidină nu pot fi înlocuite cu alanină în natură, dar această înlocuire experimentală confirmă în continuare că reziduurile mai mari de histidină blochează situsul activ. În plus, trei secvențe Gly-Gly, una în helixul N-terminal și două în motivul helix-loop-helix, ar putea servi drept balamale pe care se rotesc lanțurile pentru a deschide în continuare calea către situl catalitic și a mări activul site.

O luciferază dinoflagelată este capabilă să emită lumină datorită interacțiunii sale cu substratul său ( luciferină ) și proteina de legare a luciferinei (LBP) din organitul scintillon găsit în dinoflagelați. Luciferaza acționează în conformitate cu luciferina și LBP pentru a emite lumină, dar fiecare componentă funcționează la un pH diferit. Luciferaza și domeniile sale nu sunt active la pH 8, dar sunt extrem de active la pH-ul optim de 6,3, în timp ce LBP leagă luciferina la pH 8 și o eliberează la pH 6,3. În consecință, luciferina este eliberată doar pentru a reacționa cu o luciferază activă atunci când scintillonul este acidificat la pH 6,3. Prin urmare, pentru a scădea pH-ul, sunt deschise canale cu tensiune în membrana scintillon pentru a permite intrarea protonilor dintr-un vacuol care posedă un potențial de acțiune produs dintr-o stimulare mecanică. Prin urmare, se poate observa că potențialul de acțiune din membrana vacuolară duce la acidificare și, la rândul său, permite eliberarea luciferinei pentru a reacționa cu luciferaza în scintillon, producând un fulger de lumină albastră.

Mecanismul de reacție

Toate luciferazele sunt clasificate ca oxidoreductaze ( CE 1.13.12.- ), ceea ce înseamnă că acționează asupra donatorilor unici cu încorporare de oxigen molecular. Deoarece luciferazele provin din multe familii de proteine diverse care nu au legătură, nu există un mecanism de unificare, deoarece orice mecanism depinde de combinația de luciferază și luciferină. Cu toate acestea, toate reacțiile caracterizate de luciferază-luciferină până în prezent s-au dovedit că necesită oxigen molecular într-un anumit stadiu.

Luciferaza bacteriană

Reacția catalizată de luciferaza bacteriană este, de asemenea, un proces oxidativ:

• FMNH ₂ + O ₂ + RCHO → FMN + RCOOH + H ₂ O + lumină

În reacție, oxigenul molecular oxidează flavina mononucleotidă și o aldehidă alifatică cu lanț lung la un acid carboxilic alifatic . Reacția formează un intermediar hidroxiflavină excitat, care este deshidratat la produsul FMN pentru a emite lumină albastru-verde.

Aproape toată energia introdusă în reacție este transformată în lumină. Reacția este eficientă între 80% și 90%. În comparație, becul cu incandescență își transformă doar aproximativ 10% din energie în lumină, iar un LED de 150 de lumeni pe Watt (lm / W) transformă 20% din energia de intrare în lumină vizibilă.

Aplicații

Luciferazele pot fi produse în laborator prin inginerie genetică în mai multe scopuri. Genele luciferazei pot fi sintetizate și inserate în organisme sau transfectate în celule. Începând cu 2002, șoarecii , viermii de mătase și cartofii sunt doar câteva dintre organismele care au fost deja proiectate pentru a produce proteina.

În reacția luciferazei, lumina este emisă atunci când luciferaza acționează asupra substratului de luciferină adecvat . Emisia de fotoni poate fi detectată de aparate sensibile la lumină, cum ar fi un luminometru sau microscopuri optice modificate . Acest lucru permite observarea proceselor biologice. Deoarece excitația ușoară nu este necesară pentru bioluminescența luciferazei, există o autofluorescență minimă și, prin urmare, o fluorescență practic lipsită de fond. Prin urmare, doar 0,02 pg pot fi măsurate cu exactitate folosind un contor de scintilație standard .

În cercetarea biologică, luciferaza este utilizată în mod obișnuit ca reporter pentru a evalua activitatea transcripțională în celule care sunt transfectate cu un construct genetic care conține gena luciferazei sub controlul unui promotor de interes. În plus, moleculele proluminescente care sunt convertite în luciferină după activitatea unei anumite enzime pot fi utilizate pentru a detecta activitatea enzimei în teste de luciferază cuplate sau în două etape. Astfel de substraturi au fost utilizate pentru a detecta activitatea caspazei și activitatea citocromului P450 , printre altele.

Luciferaza poate fi, de asemenea, utilizată pentru a detecta nivelul de ATP celular în testele de viabilitate celulară sau pentru testele de activitate a kinazei. Luciferaza poate acționa ca proteină senzor ATP prin biotinilare . Biotinilarea va imobiliza luciferaza pe suprafața celulei prin legarea la un complex streptavidină - biotină . Acest lucru permite luciferazei să detecteze efluxul de ATP din celulă și va afișa eficient eliberarea în timp real a ATP prin bioluminiscență. Luciferaza poate fi în plus făcută mai sensibilă pentru detectarea ATP prin creșterea intensității luminiscenței prin schimbarea anumitor resturi de aminoacizi în secvența proteinei.

Imagistica animalelor întregi (denumită in vivo atunci când trăiește sau, numită altfel imagistica ex vivo ) este o tehnică puternică pentru studierea populațiilor de celule la animale vii, cum ar fi șoarecii. Diferite tipuri de celule (de exemplu, celule stem ale măduvei osoase, celule T) pot fi proiectate pentru a exprima o luciferază, permițând vizualizarea lor neinvazivă în interiorul unui animal viu folosind o cameră sensibilă cu dispozitiv cuplat de încărcare ( cameră CCD ). Această tehnică a fost utilizată să urmărească tumorigeneză și răspunsul tumorilor la tratament în modele animale. Cu toate acestea, factorii de mediu și interferențele terapeutice pot provoca unele discrepanțe între sarcina tumorii și intensitatea bioluminiscenței în raport cu modificările activității proliferative. Intensitatea semnalului măsurat prin imagistica in vivo poate depinde de diverși factori, cum ar fi absorbția D-luciferinei prin peritoneu, fluxul sanguin, permeabilitatea membranei celulare, disponibilitatea co-factorilor, pH-ul intracelular și transparența țesutului suprapus, pe lângă cantitatea de luciferază.

Luciferaza este o proteină sensibilă la căldură care este utilizată în studii privind denaturarea proteinelor , testând capacitățile de protecție ale proteinelor de șoc termic . Oportunitățile de utilizare a luciferazei continuă să se extindă.

Vezi si

• Luciferin
• Imagistica bioluminiscentă
• Detectarea cvorumului
• Bacterii bioluminescente

Referințe

linkuri externe