N-acil fosfatidiletanolamină specifică fosfolipazei D - N-acyl phosphatidylethanolamine-specific phospholipase D

N-acil fosfatidiletanolamină fosfolipază D
Identificatori
Simbol NAPEPLD
Gena NCBI 222236
HGNC 21683
OMIM 612334
PDB 4QN9
RefSeq NM_001122838
UniProt Q6IQ20
Alte date
Numărul CE 3.1.4.54
Locus Chr. 7 q22.1

N-acil fosfatidiletanolamina fosfolipaza D ( NAPE-PLD ) este o enzimă care catalizează eliberarea N-aciletanolaminei (NAE) din N-acil-fosfatidiletanolamina (NAPE). Aceasta este o parte majoră a procesului care transformă lipidele obișnuite în semnale chimice precum anandamida și oleoiletanolamina . La om, proteina NAPE -PLD este codificată de gena NAPEPLD .

Descoperire

NAPE-PLD este o activitate enzimatică - o fosfolipază , care acționează asupra fosfolipidelor găsite în membrana celulară . Nu este omologie , dar rezultatul chimic al activității sale pe care clase ea ca fosfolipaza D . Activitatea enzimatică a fost descoperită și caracterizată printr-o serie de experimente care au culminat cu publicarea în 2004 a unei scheme de purificare biochimică din care s-ar putea realiza secvențierea peptidelor . Cercetătorii au omogenizat (măcinat fin) inimile de la 150 de șobolani și au supus lizatul brut rezultat la sedimentarea zaharozei la 105.000 xg pentru a separa membranele celulare de restul celulei. Cele Proteinele membranare integrate au fost apoi solubilizate folosind octil glucozidă și supus la patru cromatografie în coloană pași (coloana HiTrap SP HP schimbătoare de cationi, coloana de schimb anionic HiTrap Q, coloana de afinitate HiTrap Albastru, Bio-Gel coloană hidroxiapatită HTP). Fiecare dintre acestea separă diferitele tipuri de proteine ​​de membrană în diferite recipiente de probă atunci când proteinele sunt eluate din coloană în timp și prin măsurarea activității probelor din fiecare recipient a fost posibil să se urmărească care dintre ele au primit enzima activă. Măsurarea activității enzimatice s-a făcut prin cromatografie în strat subțire a unui substrat radioactiv sensibil la activitatea enzimatică NAPE-PLD: Scindarea substratului afectat acolo unde a apărut pe placă atunci când radiația a fost detectată pe un analizor de bioimagine.

Rezultatul acestei proceduri extinse nu a fost încă o proteină pură, dar a produs un număr limitat de benzi prin SDS-PAGE și s-a constatat că o bandă de 46 kilodaltoni se corelează în intensitate cu activitatea enzimatică. Această bandă a fost tăiată din gel și digerată cu tripsină , iar peptidele din aceasta au fost separate una de alta prin cromatografie lichidă de înaltă performanță în fază inversă . Fragmentele rezultate au fost apoi micro-secvențiate printr-o degradare automată a lui Edman . Trei au corespuns vimentinei , o proteină de filament intermediară de 56 kDa considerată a fi un contaminant, iar celelalte două s-au potrivit cu clona ADNc identificată ulterior ca NAPE-PLD.

Odată ce acest indiciu a fost obținut, identificarea ar putea fi confirmată printr-o procedură mai puțin oneroasă: supraexprimarea supusă ADNc NAPE-PLD în celulele COS-7 a produs o activitate enzimatică NAPE-PLD puternică, ale cărei caracteristici s-au dovedit a fi similare cu cele ale extractul original de inimă.

Caracteristici

NAPEPLD ADNc secvență prezice 396 de aminoacizi secvențe, atât la șoareci și șobolani, care sunt de 89% și 90% identică cu cea a oamenilor. S-a constatat că NAPE-PLD nu are omologie cu genele cunoscute de fosfolipază D , dar poate fi clasificat prin omologie pentru a se încadra în familia metallohidrolazei zincului din pliul beta-lactamazei . În special, a fost observat motivul extrem de conservat H X ( E / H ) X D ( C / R / S / H ) X 50-70 H X 15-30 ( C / S / D ) X 30-70 H , care este, în general, asociată cu legarea zincului și reacția de hidroliză în această clasă de proteine, conducând autorii să propună că activitatea ar trebui corelată cu conținutul de zinc.

Când recombinant PNAO-PLD a fost testată în celule COS in vitro , a avut o activitate similară față de mai multe radiomarcați substraturi: N-palmitoylphosphatidylethanolamine, N-arachidonoylphosphatidylethanolamine, N-oleoylphosphatidylethanolamine și N-stearoylphosphatidylethanolamine toate reacționați cu K m între 2-4 micromolar și V max între 73 și 101 nanomoli pe miligram pe minut, calculat de Lineweaver – Burk plot . (Acestea generează N- palmitoylethanolamine , anandamide , N- oleoiletanolamina și N-stearoylethanolamine, respectiv) Enzima a reacționat , de asemenea , N-palmitoil-lizo-phosphatidylethanolamine și N-arachidonoyl-lizo-fosfatidiletanolamină cu K similară m , dar la o treime la unul -a patra V max . Aceste activități sunt în concordanță cu observația că multe țesuturi produc o gamă de N- aciletanolamine .

Cu toate acestea, NAPE-PLD nu a avut capacitatea de a produce acid fosfatidic detectabil din fosfatidilcolină sau fosfatidiletanolamină, așa cum este catalizat de alte enzime fosfolipază D. De asemenea, îi lipsește activitatea de transfosfatidilare a fosfolipazei D care permite crearea mai multor alcooli fosfatidilici decât acid fosfatidic în prezența etanolului sau butanolului .

Calea

Această enzimă acționează ca a doua etapă a unei căi biochimice inițiată prin crearea de N-acilfosfatidiletanolamină , prin transferul unei grupări acil din poziția sn -1 a glicerofosfolipidului pe grupa amino a fosfatidiletanolaminei . În timp ce NAPE-PLD contribuie la biosinteza mai multor NAE din sistemul nervos central al mamiferelor , nu este clar dacă această enzimă nu este responsabilă pentru formarea anandamidei endocannabinoide , deoarece s-a raportat că șoarecii knockout NAPE-PLD au un tip sălbatic. niveluri sau niveluri foarte reduse de anandamidă.

Cele N-acylethanolamines eliberate de această enzimă devin potențiale substraturi pentru grași hidrolază amida acidului (FAAH), care hidrolizează libere acizii grași din etanolamina . Defectele acestei enzime pot determina creșterea produselor NAPE-PLD, cum ar fi anandamida, până la niveluri de 15 ori mai mari decât cele observate în mod normal.

Structura

Această enzimă membranară formează homodimeri , separați parțial printr-un canal intern ∼9-Å. Pliul proteic metallo beta-lactamază este adaptat pentru a se asocia cu fosfolipide de membrană . O cavitate hidrofobă oferă o cale de intrare pentru substratul NAPE în situl activ, unde un centru binuclear de zinc îi catalizează hidroliza. Acizii biliari se leagă cu o afinitate ridicată de buzunarele selective din această cavitate, îmbunătățind ansamblul dimerilor și permițând cataliza. NAPE-PLD facilitează diafragma între semnale de acid biliar și semnale de amidă lipidică.

Referințe