Proteină fluorescentă verde - Green fluorescent protein

Proteină fluorescentă verde
Structura proteinei fluorescente verde Aequorea victoria .
Identificatori
Simbol	GFP
Pfam	PF01353
Clanul Pfam	CL0069
InterPro	IPR011584
CATH	1ema
SCOP2	1ema / SCOPe / SUPFAM
Structuri proteice disponibile: Pfam   structuri / ECOD   PDB RCSB PDB ; PDBe ; PDBj PDBsum rezumatul structurii

Proteina fluorescentă verde ( GFP ) este o proteină care prezintă o culoare verde deschis fluorescenta atunci când sunt expuse la lumină în albastru la ultraviolet gama. Eticheta GFP se referă în mod tradițional la proteina izolată mai întâi din meduza Aequorea victoria și este uneori numită avGFP . Cu toate acestea, GFP au fost găsite în alte organisme, inclusiv corali , anemone de mare , zoanitide , copepode și lancete .

GFP de la A. victoria are un vârf de excitație major la o lungime de undă de 395 nm și unul minor la 475 nm. Vârful său de emisie este de 509 nm, care se află în porțiunea inferioară verde a spectrului vizibil . Randamentul cuantic al fluorescenței (QY) al GFP este de 0,79. GFP din panselita de mare ( Renilla reniformis ) are un singur vârf de excitație major la 498 nm. GFP este un instrument excelent în multe forme de biologie datorită capacității sale de a forma un cromofor intern fără a necesita cofactori accesorii , produse genetice sau enzime / substraturi, altele decât oxigenul molecular.

În biologia celulară și moleculară , gena GFP este frecvent utilizată ca raportor de expresie . A fost folosit în forme modificate pentru a produce biosenzori și au fost create multe animale care exprimă GFP, ceea ce demonstrează o dovadă a conceptului că o genă poate fi exprimată în întregul organism dat, în organe selectate sau în celule de interes. GFP poate fi introdus la animale sau alte specii prin tehnici transgenice și menținut în genomul lor și în descendenți. Până în prezent, GFP a fost exprimat în multe specii, inclusiv bacterii, drojdii, ciuperci, pești și mamifere, inclusiv în celulele umane. Oamenii de știință Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura și Martin Chalfie au primit Premiul Nobel pentru chimie din 2008 la 10 octombrie 2008 pentru descoperirea și dezvoltarea proteinei fluorescente verzi.

Cele mai multe gene disponibile comercial pentru GFP și proteine ​​fluorescente similare au o lungime de aproximativ 730 de perechi de baze. Proteina naturală are 238 de aminoacizi. Masa sa moleculară este de 27 kD. Prin urmare, fuzionarea genei GFP cu gena unei proteine ​​de interes poate crește în mod semnificativ dimensiunea și masa moleculară a proteinei și poate afecta funcția naturală a proteinei sau poate modifica locația sau traiectoria transportului în interiorul celulei.

fundal

Aequorea victoria

Reconstrucția 3D a imaginii confocale a progenitorilor neuronali supraexprimând VEGF (roșu) și a celulelor progenitoare neuronale cu control pozitiv GFP (verde) în bulbul olfactiv de șobolan. Vasele de sânge RECA-1-pozitive - culoare albastră.

GFP de tip sălbatic (wtGFP)

În anii 1960 și 1970, GFP, împreună cu proteina luminescentă separată aequorin (o enzimă care catalizează defalcarea luciferinei , eliberând lumină), a fost purificată pentru prima dată de meduzele Aequorea victoria și proprietățile sale studiate de Osamu Shimomura . În A. victoria , fluorescența GFP apare atunci când aequorina interacționează cu ionii de Ca ²⁺ , inducând o strălucire albastră. O parte din această energie luminiscentă este transferată către GFP, schimbând culoarea generală către verde. Cu toate acestea, utilitatea sa ca instrument pentru biologii moleculari nu a început să se realizeze decât în ​​1992, când Douglas Prasher a raportat clonarea și secvența nucleotidică a wtGFP în Gene . Finanțarea pentru acest proiect s-a epuizat, așa că Prasher a trimis probe de ADNc la mai multe laboratoare. Laboratorul lui Martin Chalfie a exprimat secvența de codare a wtGFP, cu primii câțiva aminoacizi șterse, în celule heterologe de E. coli și C. elegans , publicând rezultatele în Science în 1994. Laboratorul lui Frederick Tsuji a raportat independent expresia recombinantului proteine ​​o lună mai târziu. În mod remarcabil, molecula GFP s-a pliat și a fost fluorescentă la temperatura camerei, fără a fi nevoie de cofactori exogeni specifici meduzei. Deși acest procent de wtGFP era fluorescent, avea mai multe dezavantaje, inclusiv spectre de excitație cu vârf dublu, sensibilitate la pH, sensibilitate la clorură, randament cuantic cu fluorescență slabă, fotostabilitate slabă și pliere slabă la 37 ° C.

Prima structură cristalină raportată a unui GFP a fost cea a mutantului S65T de către grupul Remington în Science în 1996. O lună mai târziu, grupul Phillips a raportat independent structura GFP de tip sălbatic în Nature Biotechnology . Aceste structuri cristaline au oferit un fundal vital asupra formării cromoforilor și a interacțiunilor vecine cu reziduurile. Cercetătorii au modificat aceste reziduuri prin mutageneză direcționată și aleatorie pentru a produce o mare varietate de derivați GFP în uz astăzi. Cercetările ulterioare în GFP au arătat că este rezistent la detergenți, proteaze, tratamente cu clorură de guanidiniu (GdmCl) și modificări drastice de temperatură.

Derivate GFP

Diversitatea mutațiilor genetice este ilustrată de această scenă de plajă din San Diego, desenată cu bacterii vii care exprimă 8 culori diferite ale proteinelor fluorescente (derivate din GFP și dsRed).

Datorită potențialului de utilizare pe scară largă și a nevoilor în evoluție ale cercetătorilor, au fost proiectate multe mutanți diferiți ai GFP. Prima îmbunătățire majoră a fost o mutație cu un singur punct (S65T) raportată în 1995 în Nature de Roger Tsien . Această mutație a îmbunătățit dramatic caracteristicile spectrale ale GFP, rezultând fluorescență crescută, fotostabilitate și o deplasare a vârfului de excitație majoră la 488 nm, cu emisia de vârf menținută la 509 nm. Acest lucru a corespuns caracteristicilor spectrale ale seturilor de filtre FITC disponibile în mod obișnuit , sporind practicitatea utilizării de către cercetătorul general. Un punct mutant al eficienței plierii la 37 ° C (F64L) mutant la această schelă, producând GFP îmbunătățit ( EGFP ), a fost descoperit în 1995 de laboratoarele Thastrup și Falkow. EGFP a permis utilizarea practică a GFP în celulele mamiferelor. EGFP are un coeficient de extincție (notat ε) de 55.000 M ^-1 cm ^-1 . Randamentul cuantic al fluorescenței (QY) al EGFP este de 0,60. Luminozitatea relativă, exprimată ca ε • QY, este de 33.000 M ⁻¹ cm ⁻¹ .

Superfolderul GFP ( sfGFP ), o serie de mutații care permit GFP să se plieze rapid și să se maturizeze chiar și atunci când este fuzionat cu peptide slab îndoite, a fost raportat în 2006.

Au fost făcute multe alte mutații, inclusiv mutanți de culoare; în special, proteina fluorescentă albastră (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteina fluorescentă cian (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) și derivații de proteine ​​fluorescente galbene (YFP, Citrin, Venus, YPet). Derivații BFP (cu excepția mKalama1) conțin substituția Y66H. Prezintă o bandă largă de absorbție în ultraviolet centrată aproape de 380 nanometri și o emisie maximă la 448 nanometri. A fost dezvoltat un mutant de proteină fluorescentă verde ( BFPms1 ) care leagă preferențial Zn (II) și Cu (II) . BFPms1 are mai multe mutații importante, inclusiv cromoforul BFP (Y66H), Y145F pentru randament cuantic mai mare, H148G pentru crearea unei găuri în baril beta și alte câteva mutații care cresc solubilitatea. Legarea Zn (II) crește intensitatea fluorescenței, în timp ce legarea Cu (II) stinge fluorescența și schimbă absorbția maximă de la 379 la 444 nm. Prin urmare, ele pot fi utilizate ca biosenzor Zn.

O paletă de variante de GFP și DsRed.

Legarea cromoforului . Mutația critică a derivaților cian este substituția Y66W, care determină formarea cromoforului cu un indol, mai degrabă decât cu un component fenol. Sunt necesare mai multe mutații compensatorii suplimentare în butoiul din jur pentru a restabili luminozitatea acestui cromofor modificat datorită volumului crescut al grupului indol. În ECFP și Cerulean, jumătatea N-terminală a celei de-a șaptea fire prezintă două conformații. Aceste conformații au ambele un set complex de interacțiuni van der Waals cu cromoforul. Mutațiile Y145A și H148D din Cerulean stabilizează aceste interacțiuni și permit cromoforului să fie mai plan, mai bine ambalat și mai puțin predispus la stingerea colizională.

Mutageneză aleatorie suplimentară direcționată către sit, în combinație cu screening-ul bazat pe fluorescență pe toată durata de viață, a stabilizat în continuare cea de-a șaptea catena β, rezultând o variantă strălucitoare, mTurquoise2, cu un randament cuantic (QY) de 0,93. Lungimea de undă deplasată spre roșu a derivaților YFP este realizată de mutația T203Y și se datorează interacțiunilor de stivuire π-electron între reziduul de tirozină substituit și cromofor. Aceste două clase de variante spectrale sunt adesea folosite pentru experimentele de transfer de energie prin rezonanță Förster ( FRET ). Reporterii FRET codați genetic, sensibili la moleculele de semnalizare celulară, cum ar fi calciu sau glutamat, starea de fosforilare a proteinelor, complementarea proteinelor, dimerizarea receptorilor și alte procese oferă citiri optice foarte specifice ale activității celulare în timp real.

Mutageneza semiațională a unui număr de reziduuri a condus la mutanți sensibili la pH, cunoscuți sub numele de pHluorine, și ulterior pHluorini superecliptici. Prin exploatarea schimbării rapide a pH-ului la fuziunea veziculelor sinaptice, pHluorinele marcate cu sinaptobrevin au fost utilizate pentru a vizualiza activitatea sinaptică în neuroni.

GFP sensibil la redox ( roGFP ) a fost proiectat prin introducerea cisteinelor în structura barilului beta. Starea redox a cisteinelor determină proprietățile fluorescente ale roGFP .

Nomenclatură

Nomenclatura GFP modificate este adesea confuză datorită mapării suprapuse a mai multor versiuni GFP pe un singur nume. De exemplu, mGFP se referă adesea la un GFP cu o palmitoilare N-terminală care determină legarea GFP de membranele celulare . Cu toate acestea, același termen este folosit și pentru a se referi la GFP monomeric , care este adesea realizat prin interfața dimerului care rupe mutația A206K. GFP de tip sălbatic are o tendință slabă de dimerizare la concentrații peste 5 mg / ml. mGFP reprezintă, de asemenea, "GFP modificat", care a fost optimizat prin schimbul de aminoacizi pentru exprimarea stabilă în celulele plantei.

În natură

Lancelet viu ( B. floridae ) la microscop fluorescent.

Fluorescență verde în copepodul marin Pontella mimocerami.

Scopul atât al bioluminiscenței (primare) (din acțiunea aequorinei asupra luciferinei), cât și al fluorescenței (secundare) a GFP la meduze este necunoscut. GFP este co-exprimat cu aequorin în granule mici în jurul marginii clopotului pentru meduze. Vârful de excitație secundar (480 nm) al GFP absorb o parte din emisia albastră a echorinei, dând bioluminescenței o nuanță mai verde. Reziduul de serină 65 al cromoforului GFP este responsabil pentru spectrele de excitație cu vârf dublu al GFP de tip sălbatic. Este conservat în toate cele trei izoforme GFP clonate inițial de Prasher. Aproape toate mutațiile acestui reziduu consolidează spectrele de excitație la un singur vârf la 395 nm sau 480 nm. Mecanismul precis al acestei sensibilități este complex, dar, se pare, implică donarea unui hidrogen de la serină 65 la glutamat 222, care influențează ionizarea cromoforului. Deoarece o singură mutație poate spori dramatic vârful de excitație de 480 nm, făcând GFP un partener mult mai eficient al aequorinei, A. victoria pare să prefere în mod evolutiv spectrul de excitație cu vârf dublu mai puțin eficient. Roger Tsien a speculat că variația presiunii hidrostatice cu adâncimea poate afecta capacitatea serinei 65 de a dona un hidrogen către cromofor și de a schimba raportul celor două vârfuri de excitație. Astfel, meduzele pot schimba culoarea bioluminescenței sale cu adâncimea. Cu toate acestea, o prăbușire a populației de meduze din Friday Harbor , unde a fost descoperită inițial GFP, a împiedicat studiul suplimentar al rolului GFP în mediul natural al meduzelor.

Se știe că majoritatea speciilor de lancelet produc GFP în diferite regiuni ale corpului lor. Spre deosebire de A. victoria , lancetele nu își produc propria lumină albastră, iar originea GFP endogenă este încă necunoscută. Unii speculează că atrage planctonul spre gura lanceletului, servind ca mecanism de vânătoare pasiv. Poate servi și ca agent fotoprotector în larve, prevenind daunele cauzate de lumina albastră de intensitate mare prin transformarea ei în lumină verde de intensitate mai mică. Cu toate acestea, aceste teorii nu au fost testate.

Proteinele asemănătoare GFP au fost găsite în mai multe specii de copepode marine , în special din familiile Pontellidae și Aetideidae . GFP izolat din Pontella mimocerami a arătat niveluri ridicate de luminozitate cu un randament cuantic de 0,92, făcându-le aproape de două ori mai strălucitoare decât EGFP uzat în mod obișnuit, izolat din A. victoria.

Alte proteine ​​fluorescente

Diferite proteine ​​produc diferite culori fluorescente atunci când sunt expuse la lumina ultravioletă.

Există multe proteine ​​asemănătoare GFP care, deși se află în aceeași familie de proteine ​​ca GFP, nu sunt derivate direct din Aequorea victoria . Acestea includ dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP / IrisFP, Dendra și așa mai departe. Fiind dezvoltate din proteine ​​din diferite organisme, aceste proteine ​​pot prezenta uneori abordări neantipate la formarea cromoforilor. Unele dintre acestea, cum ar fi KFP, sunt dezvoltate din proteine ​​fluorescente în mod natural sau slab fluorescente, pentru a fi mult îmbunătățite prin mutageneză. Când se folosesc butoaie asemănătoare GFP cu diferite caracteristici spectrale, spectrele de excitație ale unui cromofor pot fi utilizate pentru a alimenta un alt cromofor (FRET), permițând conversia între lungimile de undă ale luminii.

Proteinele fluorescente care leagă FMN (FbFP) au fost dezvoltate în 2007 și sunt o clasă de proteine ​​fluorescente mici (11-16 kDa), independente de oxigen, care sunt derivate din receptorii de lumină albastră. Acestea sunt destinate în special utilizării în condiții anaerobe sau hipoxice, deoarece formarea și legarea cromoforului Flavin nu necesită oxigen molecular, așa cum este cazul sintezei cromoforului GFP.

Imagine cu lumină albă sau imagine văzută de ochi, a proteinelor fluorescente din imaginea de mai sus.

Proteinele fluorescente cu alți cromofori, cum ar fi UnaG cu bilirubină, pot afișa proprietăți unice, cum ar fi emisia redată la 600 nm sau fotoconversia de la o stare de emisie verde la o stare de emisie de roșu. Ele pot avea lungimi de undă de excitație și emisie suficient de îndepărtate pentru a realiza conversia între lumina roșie și cea verde.

O nouă clasă de proteine fluorescente a fost evoluat de la un cyanobacterial ( Trichodesmium erythraeum ) ficobiliproteina , α- alloficocianina si ultra mici numita proteina roșu fluorescent ( smURFP ) în 2016. smURFP autocatalitic auto-încorporează cromofor biliverdin fără necesitatea unui extern de proteine , cunoscut sub numele de lyase . Meduzele și proteinele GFP derivate din corali necesită oxigen și produc o cantitate stoichiometrică de peroxid de hidrogen la formarea cromoforului . smURFP nu necesită oxigen sau produce peroxid de hidrogen și folosește cromoforul , biliverdinul . smURFP are un coeficient de extincție mare (180.000 M ^-1 cm ^-1 ) și are un randament cuantic modest (0,20), ceea ce îl face să fie luminozitate biofizică comparabilă cu eGFP și ~ de 2 ori mai strălucitoare decât majoritatea proteinelor fluorescente roșii sau roșii îndepărtate derivate din coral . proprietățile spectrale smURFP sunt similare cu colorantul organic Cy5 .

Colonii de E. coli care exprimă proteine ​​fluorescente.

Recenzii privind noile clase de proteine ​​fluorescente și aplicații pot fi găsite în recenziile citate.

Structura

Model pentru formarea spontană a fluoroforului HBI (evidențiat în verde) în wtGFP.

GFP are o structură cu țeavă beta formată din unsprezece β-catene cu un aranjament de folie pliată, cu o helix alfa care conține cromoforul legat covalent 4- ( p- hidroxibenziliden) imidazolidin-5-ona (HBI) care trece prin centru. Cinci helice alfa mai scurte formează capace la capetele structurii. Structura barilului beta este un cilindru aproape perfect, lung de 42Å și diametru de 24Å (unele studii au raportat un diametru de 30Å), creând ceea ce se numește o formațiune "β-cutie", care este unică pentru familia GFP . HBI, forma modificată spontan a tripeptidei Ser65 – Tyr66 – Gly67, este non-fluorescentă în absența schelei GFP pliate corespunzător și există în principal în forma fenolică neionizată în wtGFP. Lanțurile laterale ale butoiului orientate spre interior induc reacții specifice de ciclizare în Ser65 – Tyr66 – Gly67 care induc ionizarea HBI în forma fenolată și formarea cromoforului . Acest proces de modificare post-translațională este denumit maturizare . Rețeaua de legare a hidrogenului și interacțiunile de stivuire a electronilor cu aceste lanțuri laterale influențează culoarea, intensitatea și fotostabilitatea GFP și a numeroșilor săi derivați. Natura strâns ambalată a butoiului exclude moleculele de solvent, protejând fluorescența cromoforului de stingerea cu apă. În plus față de autociclizarea Ser65-Tyr66-Gly67, are loc o reacție de 1,2-dehidrogenare la reziduul Tyr66. Pe lângă cele trei reziduuri care formează cromoforul, reziduuri precum Gln94, Arg96, His148, Thr203 și Glu222 acționează ca stabilizatori. Reziduurile de Gln94, Arg96 și His148 sunt capabile să se stabilizeze prin delocalizarea sarcinii cromofore. Arg96 este cel mai important reziduu stabilizator datorită faptului că determină realinierile structurale necesare care sunt necesare din inelul HBI. Orice mutație a reziduului Arg96 ar duce la o scădere a ratei de dezvoltare a cromoforului, deoarece interacțiunile electrostatice și sterice adecvate s-ar pierde. Tyr66 este receptorul legăturilor de hidrogen și nu ionizează pentru a produce electrostatice favorabile.

Film GFP care prezintă întreaga structură și se apropie de cromoforul fluorescent.

Molecule GFP desenate în stil desen animat, una completă și una cu partea laterală a butoiului beta tăiată pentru a dezvălui cromoforul (evidențiat sub formă de bilă și stick ). Din PDB : 1GFL .

Diagrama panglicii GFP. De la PDB : 1EMA .

Aplicații

Testele reporterului

Proteina fluorescentă verde poate fi utilizată ca genă reporter .

De exemplu, GFP poate fi utilizat ca reporter pentru nivelurile de toxicitate asupra mediului. S-a dovedit că această proteină este o modalitate eficientă de a măsura nivelurile de toxicitate ale diferitelor substanțe chimice, inclusiv etanol, p- formaldehidă, fenol, triclosan și paraben. GFP este excelent ca proteină reporter, deoarece nu are niciun efect asupra gazdei atunci când este introdus în mediul celular al gazdei. Datorită acestei abilități, nu sunt necesare pete de vizualizare externe, ATP sau cofactori. În ceea ce privește nivelurile de poluanți, fluorescența a fost măsurată pentru a evalua efectul pe care poluanții îl au asupra celulei gazdă. Densitatea celulară a celulei gazdă a fost, de asemenea, măsurată. Rezultatele studiului realizat de Song, Kim și Seo (2016) au arătat că a existat o scădere atât a fluorescenței, cât și a densității celulare, pe măsură ce nivelurile de poluanți au crescut. Acest lucru a indicat faptul că activitatea celulară a scăzut. Mai multe cercetări în această aplicație specifică pentru a determina mecanismul prin care GFP acționează ca un marker poluant. Rezultate similare au fost observate la peștele zebră, deoarece peștele zebră care a fost injectat cu GFP a fost de aproximativ douăzeci de ori mai susceptibil să recunoască stresurile celulare decât zebrul care nu a fost injectat cu GFP.

Avantaje

Cel mai mare avantaj al GFP este că poate fi ereditar, în funcție de modul în care a fost introdus, permițând studiul continuu al celulelor și țesuturilor în care este exprimat. Vizualizarea GFP este neinvazivă, necesitând doar iluminare cu lumină albastră. GFP singur nu interferează cu procesele biologice, dar atunci când este fuzionat cu proteinele de interes, este necesară proiectarea atentă a linkerilor pentru a menține funcția proteinei de interes. Mai mult, dacă este utilizat cu un monomer, este capabil să se difuzeze ușor în celule.

Microscopie fluorescentă

Superrezoluție cu două proteine ​​de fuziune (GFP-Snf2H și RFP-H2A), studii de co-localizare (2CLM) în nucleul unei celule canceroase osoase. 120.000 de molecule localizate într-o zonă largă (470 µm ² ).

Disponibilitatea GFP și a derivaților săi a redefinit complet microscopia cu fluorescență și modul în care este utilizat în biologia celulară și în alte discipline biologice. În timp ce majoritatea moleculelor fluorescente mici, cum ar fi FITC (izotiocianat de fluoresceină), sunt puternic fototoxice atunci când sunt utilizate în celulele vii, proteinele fluorescente precum GFP sunt de obicei mult mai puțin dăunătoare atunci când sunt iluminate în celulele vii. Acest lucru a declanșat dezvoltarea unor sisteme de microscopie cu fluorescență cu celule vii extrem de automatizate, care pot fi utilizate pentru a observa celulele în timp exprimând una sau mai multe proteine ​​etichetate cu proteine ​​fluorescente.

Există multe tehnici pentru a utiliza GFP într-un experiment de imagistică cu celule vii. Cea mai directă modalitate de utilizare a GFP este de a o atașa direct la o proteină de interes. De exemplu, GFP poate fi inclus într-o plasmidă care exprimă alte gene pentru a indica o transfecție reușită a unei gene de interes. O altă metodă este utilizarea unui GFP care conține o mutație în care fluorescența se va schimba de la verde la galben în timp, care este denumită temporizator fluorescent. Cu ajutorul temporizatorului fluorescent, cercetătorii pot studia starea producției de proteine, cum ar fi activarea recentă, activarea continuă sau dezactivarea recentă pe baza culorii raportate de proteina fluorescentă. Într-un alt exemplu, oamenii de știință au modificat GFP pentru a deveni activ numai după expunerea la iradiere, oferind cercetătorilor un instrument pentru a activa selectiv anumite porțiuni ale unei celule și a observa unde proteinele marcate cu GFP se deplasează de la locul de pornire. Acestea sunt doar două exemple într-un câmp în creștere al microcopiei fluorescente și o revizuire mai completă a biosenzorilor care utilizează GFP și alte proteine ​​fluorescente pot fi găsite aici

De exemplu, GFP a fost utilizat pe scară largă în etichetarea spermatozoizilor diferitelor organisme în scopuri de identificare ca în Drosophila melanogaster , unde expresia GFP poate fi utilizată ca marker pentru o anumită caracteristică. GFP poate fi, de asemenea, exprimat în diferite structuri care permit distincția morfologică. În astfel de cazuri, gena pentru producerea GFP este încorporată în genomul organismului din regiunea ADN-ului care codifică proteinele țintă și care este controlată de aceeași secvență reglatoare ; adică secvența reglatoare a genei controlează acum producția de GFP, în plus față de proteina (proteinele) marcată (e). În celulele în care gena este exprimată și proteinele marcate sunt produse, GFP este produs în același timp. Astfel, numai acele celule în care este exprimată gena marcată sau sunt produse proteinele țintă, vor fluoresc atunci când sunt observate la microscopie cu fluorescență. Analiza unor astfel de filme de tip time lapse a redefinit înțelegerea multor procese biologice, inclusiv plierea proteinelor, transportul proteinelor și dinamica ARN, care în trecut au fost studiate folosind material fix (adică mort). Datele obținute sunt, de asemenea, utilizate pentru a calibra modele matematice ale sistemelor intracelulare și pentru a estima ratele de exprimare a genelor. În mod similar, GFP poate fi utilizat ca indicator al expresiei proteinelor în sistemele heteroloage. În acest scenariu, proteinele de fuziune care conțin GFP sunt introduse indirect, folosind ARN-ul constructului sau direct, cu proteina marcată în sine. Această metodă este utilă pentru studierea caracteristicilor structurale și funcționale ale proteinei marcate pe o scară macromoleculară sau cu o singură moleculă cu microscopie fluorescentă.

Vertico SMI microscop folosind tehnologia SPDM Phymod utilizează așa-numitul „fotooxidare reversibil“ efectul de coloranți fluorescenți cum ar fi GFP și derivații săi pentru a le localiza ca molecule unice la o rezoluție optică de 10 nm. Aceasta poate fi realizată și ca o co-localizare a doi derivați GFP (2CLM).

O altă utilizare puternică a GFP este de a exprima proteina în seturi mici de celule specifice. Acest lucru permite cercetătorilor să detecteze optic anumite tipuri de celule in vitro (într-un vas) sau chiar in vivo (în organismul viu). Combinarea genetică a mai multor variante spectrale ale GFP este un truc util pentru analiza circuitelor cerebrale ( Brainbow ). Alte utilizări interesante ale proteinelor fluorescente din literatură includ utilizarea FP ca senzori ai potențialului membranei neuronale , urmărirea receptorilor AMPA pe membranele celulare, intrarea virală și infecția virușilor gripali individuali și a virusurilor lentivirale etc.

De asemenea, s-a constatat că noile linii de șobolani transgenici GFP pot fi relevante pentru terapia genică, precum și pentru medicina regenerativă. Prin utilizarea GFP "cu expresor ridicat", șobolanii transgenici prezintă o expresie ridicată în majoritatea țesuturilor și multe celule care nu au fost caracterizate sau au fost slab caracterizate doar la șobolanii transgenici GFP anteriori.

GFP s-a dovedit a fi util în criobiologie ca test de viabilitate . Corelația viabilității măsurată prin teste de albastru trypan a fost de 0,97. O altă aplicație este utilizarea co-transfecției GFP ca control intern pentru eficiența transfecției în celulele de mamifere.

O nouă posibilă utilizare a GFP include utilizarea acestuia ca monitor sensibil al proceselor intracelulare printr-un sistem laser eGFP realizat dintr-o linie de celule renale embrionare umane. Primul laser viu realizat este realizat de o celulă eGFP care exprimă în interiorul unei cavități optice reflectorizante și o lovește cu impulsuri de lumină albastră. La un anumit prag de impuls, ieșirea optică a eGFP devine mai strălucitoare și complet uniformă în culoarea verde pur cu o lungime de undă de 516 nm. Înainte de a fi emisă ca lumină laser, lumina ricoșează înainte și înapoi în cavitatea rezonatorului și trece celula de mai multe ori. Studiind modificările activității optice, cercetătorii pot înțelege mai bine procesele celulare.

GFP este utilizat pe scară largă în cercetarea cancerului pentru a marca și urmări celulele canceroase. Celulele canceroase marcate cu GFP au fost utilizate pentru modelarea metastazelor, procesul prin care celulele canceroase se răspândesc în organele îndepărtate.

GFP divizat

GFP poate fi utilizat pentru a analiza colocalizarea proteinelor. Acest lucru se realizează prin „împărțirea” proteinei în două fragmente care sunt capabile să se auto-asambleze și apoi fuzionează fiecare dintre acestea cu cele două proteine ​​de interes. Singuri, aceste fragmente GFP incomplete sunt incapabile să fluorizeze. Cu toate acestea, dacă cele două proteine ​​de interes se colocalizează, atunci cele două fragmente GFP se asamblează împreună pentru a forma o structură asemănătoare GFP, care este capabilă să fluorescă. Prin urmare, prin măsurarea nivelului de fluorescență este posibil să se determine dacă cele două proteine ​​de interes se colocalizează.

Macrofotografie

Procesele biologice la scară macro, cum ar fi răspândirea infecțiilor cu virusuri, pot fi urmărite folosind etichetarea GFP. În trecut, lumina ultravioletă mutagenă (UV) a fost utilizată pentru iluminarea organismelor vii (de exemplu, vezi) pentru a detecta și fotografia expresia GFP. Recent, a fost dezvoltată o tehnică care utilizează lumini LED non-mutagene pentru macro-fotografie. Tehnica folosește un atașament al camerei de epifluorescență bazat pe același principiu utilizat în construcția microscopurilor de epifluorescență .

Animale de companie transgenice

Șoareci care exprimă GFP sub lumină UV (stânga și dreapta), comparativ cu mouse-ul normal (centru)

Alba , un iepure verde-fluorescent, a fost creat de un laborator francez comandat de Eduardo Kac folosind GFP în scopuri de artă și comentarii sociale. Compania americană Yorktown Technologies comercializează pe acvariu magazinele de zebră fluorescentă verde ( GloFish ) care au fost inițial dezvoltate pentru a detecta poluarea pe căile navigabile. NeonPets, o companie din SUA a comercializat șoareci fluorescenți verzi în industria animalelor de companie sub numele de NeonMice. Porcii fluorescenți verzi, cunoscuți sub numele de Noels, au fost crescuți de un grup de cercetători condus de Wu Shinn-Chih la Departamentul de Știință și Tehnologie a Animalelor de la Universitatea Națională din Taiwan . O echipă japoneză-americană a creat pisici fluorescente verzi ca dovadă a conceptului pentru a le folosi potențial ca organisme model pentru boli, în special HIV . În 2009, o echipă sud-coreeană de la Universitatea Națională din Seul a crescut primii beagles transgenici cu celule fibroblaste din anemoni de mare. Câinii emit o lumină fluorescentă roșie și sunt meniți să le permită oamenilor de știință să studieze genele care provoacă boli umane precum narcolepsie și orbire.

Artă

Julian Voss-Andreae , un artist de origine germană, specializat în „sculpturi proteice”, a creat sculpturi bazate pe structura GFP, inclusiv „Proteina fluorescentă verde” înaltă de 1,70 m (5'6 ") (2004) și 1,40 m ( 4'7 ") înălțime" Meduze din oțel "(2006). Această din urmă sculptura se află la locul descoperirii GFP lui de Shimomura în 1962, Universitatea din Washington , e Friday Harbor Laboratories .

Sculptura bazată pe GFP a lui Julian Voss-Andreae , Steel Jellyfish (2006). Imaginea prezintă sculptura din oțel inoxidabil la Laboratoarele Friday Harbor de pe insula San Juan (Washington, SUA), locul descoperirii GFP.

Vezi si

• Etichetă proteică
• pGLO
• Proteină fluorescentă galbenă
• Indicator de tensiune codificat genetic

Referințe

Lecturi suplimentare

linkuri externe

• Un articol cuprinzător despre proteinele fluorescente la Scholarpedia
• Scurt rezumat al documentelor GFP de referință
• Applet Java interactiv care demonstrează chimia din spatele formării cromoforului GFP
• Video al conferinței din 2008 a lui Roger Tsien despre proteinele fluorescente
• Spectre de excitație și emisie pentru diverse proteine ​​fluorescente
• Număr tematic de proteine ​​fluorescente verzi Chem Soc Rev dedicat câștigătorilor Premiului Nobel pentru chimie din 2008, profesorilor Osamu Shimomura , Martin Chalfie și Roger Y. Tsien
• Molecula lunii, iunie 2003 : o imagine de ansamblu ilustrată a GFP de David Goodsell.
• Molecula lunii, iunie 2014 : o prezentare generală ilustrată a variantelor asemănătoare GFP de David Goodsell.
• Green Fluorescent Protein on FPbase, o bază de date cu proteine ​​fluorescente
• Prezentare generală a tuturor informațiilor structurale disponibile în PDB pentru UniProt : P42212 (Proteină fluorescentă verde) la PDBe-KB .