Biblioteca (biologie) - Library (biology)

Mutageneza de saturație a site-ului este un tip de mutageneză direcționată către site . Această imagine arată mutageneza de saturație a unei singure poziții într-o proteină teoretică cu 10 reziduuri. Versiunea de tip sălbatic a proteinei este prezentată în partea de sus, M reprezentând primul aminoacid metionină și * reprezentând încheierea traducerii. Toți cei 19 mutanți ai izoleucinei în poziția 5 sunt arătați mai jos.

Modul în care bibliotecile de ADN sunt generate prin mutageneză aleatorie în spațiul secvenței eșantionului. Este prezentat aminoacidul substituit într-o poziție dată. Fiecare punct sau set de puncte conectate este un membru al bibliotecii. PCR predispus la erori mută aleatoriu unele reziduuri la alți aminoacizi. Scanarea cu alanină înlocuiește fiecare reziduu al proteinei cu alanină, unul câte unul. Saturația locului înlocuiește fiecare dintre cei 20 de aminoacizi posibili (sau un subset al acestora) într-o singură poziție, unul câte unul.

În biologia moleculară , o bibliotecă este o colecție de fragmente de ADN care este stocată și propagată într-o populație de microorganisme prin procesul de clonare moleculară . Există diferite tipuri de biblioteci ADN, inclusiv biblioteci ADNc (formate din ARN transcris invers ), biblioteci genomice (formate din ADN genomic) și biblioteci mutante randomizate (formate prin sinteză genică de novo în care sunt încorporate nucleotide sau codoni alternativi). Tehnologia bibliotecii ADN este un pilon al biologiei moleculare actuale , ingineriei genetice și ingineriei proteinelor , iar aplicațiile acestor biblioteci depind de sursa fragmentelor originale de ADN. Există diferențe în vectorii și tehnicile de clonare utilizate în prepararea bibliotecii, dar, în general, fiecare fragment de ADN este inserat în mod unic într-un vector de clonare și rezerva de molecule de ADN recombinant este apoi transferată într-o populație de bacterii (un cromozom artificial bacterian sau o bibliotecă BAC ) sau drojdie astfel încât fiecare organism să conțină în medie o construcție (vector + inserție). Pe măsură ce populația de organisme crește în cultură, moleculele de ADN conținute în ele sunt copiate și propagate (astfel, „clonate”).

Terminologie

Termenul "bibliotecă" se poate referi la o populație de organisme, fiecare dintre care poartă o moleculă de ADN inserată într-un vector de clonare sau, alternativ, la colectarea tuturor moleculelor de vector clonate.

biblioteci ADNc

O bibliotecă de ADNc reprezintă o probă de ARNm purificat dintr-o anumită sursă (fie o colecție de celule, un anumit țesut sau un întreg organism), care a fost convertită înapoi într-un șablon de ADN prin utilizarea enzimei revers transcriptază . Acesta reprezintă astfel genele care erau transcrise în mod activ în acea sursă în condițiile fiziologice, de dezvoltare sau de mediu care existau atunci când ARNm a fost purificat. Bibliotecile ADNc pot fi generate folosind tehnici care promovează clone „de lungime completă” sau în condiții care generează fragmente mai scurte utilizate pentru identificarea „ etichetelor de secvență exprimate ”.

Bibliotecile ADNc sunt utile în genetică inversă, dar reprezintă doar o porțiune foarte mică (mai puțin de 1%) din genomul general al unui organism dat.

Aplicațiile bibliotecilor ADNc includ:

• Descoperirea unor gene noi
• Clonarea moleculelor ADNc de lungime completă pentru studiul in vitro al funcției genelor
• Studiul repertoriului de ARNm exprimat în diferite celule sau țesuturi
• Studiul îmbinării alternative în diferite celule sau țesuturi

Biblioteci genomice

O bibliotecă genomică este un set de clone care reprezintă împreună întregul genom al unui anumit organism. Numărul de clone care constituie o bibliotecă genomică depinde de (1) dimensiunea genomului în cauză și (2) de dimensiunea inserției tolerată de sistemul de vector de clonare particular . În cele mai multe scopuri practice, sursa tisulară a ADN-ului genomic nu este importantă, deoarece fiecare celulă a corpului conține ADN practic identic (cu unele excepții).

Aplicațiile bibliotecilor genomice includ:

• Determinarea secvenței genomice complete a unui anumit organism (a se vedea proiectul genomului )
• Servind ca sursă de secvență genomică pentru generarea de animale transgenice prin inginerie genetică
• Studiul funcției secvențelor reglatoare in vitro
• Studiul mutațiilor genetice în țesuturile canceroase

Biblioteci mutante sintetice

Prezentarea unei modalități obișnuite de clonare a unei biblioteci de mutageneză direcționată către sit (adică, folosind oligo degenerat). Gena de interes este PCRed cu oligos care conțin o regiune care este perfect complementară șablonului (albastru) și una care diferă de șablon prin una sau mai multe nucleotide (roșu). Multe astfel de primeri care conțin degenerare în regiunea non-complementară sunt grupate în aceeași PCR, rezultând mulți produse PCR diferite cu mutații diferite în acea regiune (mutanți individuali prezentați cu culori diferite mai jos).

Spre deosebire de tipurile de biblioteci descrise mai sus, există o varietate de metode artificiale pentru realizarea bibliotecilor de gene genetice. Variația în întreaga gena poate fi introdusă în mod aleatoriu fie prin PCR predispus la erori , permutarea ADN - ului la parti recombina de gene similare împreună, sau metode bazate pe transpozon pentru a introduce indels . Alternativ, mutațiile pot fi direcționate către codoni specifici în timpul sintezei de novo sau mutagenezei de saturație pentru a construi unul sau mai mulți mutanți punctuali ai unei gene într-un mod controlat. Acest lucru are ca rezultat un amestec de molecule de ADN dublu catenar care reprezintă variante ale genei originale.

Cele exprimate proteine din aceste biblioteci pot fi apoi analizate pentru variantele care prezintă proprietăți favorabile ( de exemplu , stabilitate, afinitate de legare sau de enzimă de activitate). Acest lucru poate fi repetat în cicluri de creare a variantelor genetice și de screening al produselor de expresie într-un proces de evoluție direcționat .

Prezentare generală a tehnicilor de pregătire a bibliotecii ADNc

Extragerea ADN-ului

Dacă se creează o bibliotecă de ARNm (adică cu clone ADNc), există mai multe protocoale posibile pentru izolarea ARNm cu lungime totală. Pentru a extrage ADN pentru bibliotecile de ADN genomic (cunoscut și sub numele de ADNc), poate fi util un mini-preparat ADN.

Pregătiți inserții

Bibliotecile ADNc necesită îngrijire pentru a se asigura că clonele de lungime completă ale ARNm sunt capturate ca ADNc (care ulterior va fi inserat în vectori). Mai multe protocoale au fost concepute pentru a optimiza sinteza catenei 1 cADN și a catenei 2 cADN din acest motiv și, de asemenea, pentru a face clonarea direcțională în vector mai probabilă.

Fragmentele ADNc sunt generate din ADNc extras prin utilizarea enzimelor de restricție frecvente nespecifice.

Vectori

Secvențele de nucleotide de interes sunt păstrate ca inserții într-o plasmidă sau în genomul unui bacteriofag care a fost utilizat pentru a infecta celulele bacteriene.

Vectorii sunt răspândiți cel mai frecvent în celulele bacteriene, dar dacă se utilizează un YAC (drojdie cromozom artificial), atunci pot fi utilizate celule de drojdie. Vectorii ar putea fi, de asemenea, răspândiți în viruși, dar acest lucru poate fi consumator de timp și obositor. Cu toate acestea, eficiența ridicată a transfecției obținută prin utilizarea virușilor (adesea fagi) îi face utili pentru ambalarea vectorului (cu inserția ligată) și apoi introducerea lor în celula bacteriană (sau drojdie).

În plus, pentru bibliotecile de ADNc, a fost dezvoltat un sistem care utilizează fagul Lambda Zap II, ExAssist și 2 specii de E. coli. Un sistem Cre-Lox care utilizează site-uri loxP și expresia in vivo a enzimei recombinazei poate fi de asemenea utilizat în schimb. Acestea sunt exemple de sisteme de excizie in vivo. Excizia in vitro implică subclonarea folosind adesea enzime de restricție tradiționale și strategii de clonare. Excizia in vitro poate consuma mai mult timp și poate necesita mai multă muncă „practică” decât sistemele de excizie in vivo. În ambele cazuri, sistemele permit mișcarea vectorului din fag într-o celulă vie, unde vectorul se poate replica și propaga până când biblioteca va fi utilizată.

Folosirea bibliotecilor

Flux de lucru pentru screeningul unei biblioteci sintetice pentru identificarea celulelor care produc o substanță chimică de interes.

Aceasta implică „screening” pentru secvențele de interes. Există mai multe metode posibile pentru a realiza acest lucru.

Referințe

linkuri externe