Diferențierea dirijată - Directed differentiation
Diferențiere regia este o bioinginerie metodologie la interfata de biologie de celule stem , biologie de dezvoltare și ingineria țesuturilor . În esență, valorifică potențialul celulelor stem prin limitarea diferențierii lor in vitro către un anumit tip de celulă sau țesut de interes. Celulele stem sunt prin definiție pluripotente , capabile să se diferențieze în mai multe tipuri de celule , cum ar fi neuroni , cardiomiocite , hepatocite , etc. Eficient diferențiere direcționată necesită o înțelegere detaliată a descendență și soarta celulelor de decizie, de multe ori furnizate de biologie de dezvoltare.
Cadrul conceptual
În timpul diferențierii, celulele pluripotente iau o serie de decizii de dezvoltare pentru a genera mai întâi cele trei straturi germinale ( ectoderm , mesoderm și endoderm ) ale embrionului și ale progenitorilor intermediari, urmate de decizii ulterioare sau puncte de control, dând naștere tuturor țesuturilor mature ale corpului. Procesul de diferențiere poate fi modelat ca o succesiune de decizii binare bazate pe modele probabilistice sau stochastice . Biologia dezvoltării și embriologia oferă cunoștințele de bază despre diferențierea tipurilor de celule prin analiza mutației , trasarea liniei, micro-manipularea embrionilor și studii de expresie genică . Diferențierea celulară și organogeneza țesuturilor implică un set limitat de căi de semnalizare a dezvoltării . Este astfel posibilă direcționarea destinului celulei prin controlul deciziilor celulare prin semnalizare extracelulară, mimând semnalele de dezvoltare.
Material sursă
Diferențierea dirijată se aplică în principal celulelor stem pluripotente (PSC) de origine mamiferă, în special celulelor șoareci și umane pentru aplicații de cercetare biomedicală . De la descoperirea celulelor stem embrionare (ES) (1981) și a celulelor stem pluripotente induse (iPS) (2006), materialul sursă este potențial nelimitat. Din punct de vedere istoric, au fost utilizate și celule de carcinom embrionar (EC). Fibroblastele sau alte tipuri de celule diferențiate au fost utilizate pentru strategii directe de reprogramare .
Metode
Diferențierea celulară implică o tranziție de la un mod proliferativ la un mod de diferențiere. Diferențierea direcționată constă în imitarea deciziilor de dezvoltare (dezvoltarea embrionului) in vitro folosind celulele stem ca material sursă. În acest scop, celulele stem pluripotente (PSC) sunt cultivate în condiții controlate care implică substrat specific sau matrici extracelulare care promovează aderența și diferențierea celulelor și definesc compozițiile mediului de cultură . Un număr limitat de factori de semnalizare, cum ar fi factorii de creștere sau moleculele mici , care controlează diferențierea celulară, se aplică secvențial sau într-o manieră combinatorie, la doze și timp de expunere variați. Diferențierea corectă a tipului de interes celular este verificată prin analiza markerilor specifici tipului celulei , a profilului de expresie genică și a analizelor funcționale.
Metode timpurii
- co-cultură cu celule stromale sau celule de alimentare și pe substraturi de cultură specifice:
celulele și matricile de sprijin oferă semnale de mediu asemănătoare dezvoltării.
- Formarea de agregate celulare 3D, denumite corpuri embrionice (EB): agregatul vizează imitarea dezvoltării embrionare timpurii și instruirea diferențierii celulare.
- cultură în prezența serului fetal bovin , îndepărtarea factorilor de pluripotență.
Metodologii actuale
Diferențierea dirijată
Această metodă constă în expunerea celulelor la modulatori de căi de semnalizare specifice și manipularea condițiilor de cultură celulară (de mediu sau exogene) pentru a imita secvența naturală a deciziilor de dezvoltare pentru a produce un tip / țesut celular dat. Un dezavantaj al acestei abordări este necesitatea de a avea o bună înțelegere a modului în care se formează tipul de interes celular.
Reprogramare directă
Această metodă, cunoscută și sub numele de transdiferențiere sau conversie directă, constă în supraexprimarea unuia sau mai multor factori, de obicei factori de transcripție, introduși în celule. Materialul de pornire poate fi fie celule stem pluripotente (PSC), fie tip de celule diferențiate, cum ar fi fibroblaste. Principiul a fost demonstrat pentru prima dată în 1987 cu factorii miogeni MyoD. Un dezavantaj al acestei abordări este introducerea acidului nucleic străin în celule și expresia forțată a factorilor de transcripție, care efecte nu sunt pe deplin înțelese.
Selecție specifică tipului de linie / celulă
Această metodă constă în selectarea tipului de celule de interes, de obicei cu rezistență la antibiotice . În acest scop, celulele materialului sursă sunt modificate pentru a conține casetă de rezistență la antibiotice sub un promotor specific de tip celulă țintă . Doar celulele angajate în linia de interes supraviețuiesc selecției .
Aplicații
Diferențierea direcționată oferă o sursă de celule și țesuturi potențial nelimitată și manipulabilă. Unele aplicații sunt afectate de fenotipul imatur al tipului de celule derivate din celule stem pluripotente (PSC), care limitează studiile fiziologice și funcționale posibile. Au apărut mai multe domenii de aplicații:
Sistem model pentru știința de bază
Pentru știința de bază , în special biologia dezvoltării și biologia celulară , celulele derivate din PSC permit să studieze la nivel molecular și celular întrebări fundamentale in vitro, care ar fi fost altfel extrem de dificil sau imposibil de studiat din motive tehnice și etice in vivo, cum ar fi embrionarii. dezvoltarea omului. În special, diferențierea celulelor este posibilă pentru studii cantitative și calitative. Procesele mai complexe pot fi, de asemenea, studiate in vitro și au fost descrise formarea de organoizi, inclusiv cerebroizi, cupă optică și rinichi .
Descoperirea și toxicologia medicamentelor
Tipurile de celule diferențiate de celulele stem pluripotente (PSC) sunt evaluate ca modele preclinice in vitro ale bolilor umane. Tipurile de celule umane dintr-un vas oferă o alternativă la testele preclinice tradiționale care utilizează celule animale, umane imortalizate sau culturi primare din biopsii , care au limitările lor. Tipurile de celule relevante din punct de vedere clinic, adică tipul de celule afectate de boli, reprezintă un obiectiv major al cercetării, inclusiv hepatocitele , celulele beta ale insulelor Langerhans , cardiomiocitele și neuronii . Ecranul medicamentului se efectuează pe cultura celulară miniaturizată în plăci cu mai multe godeuri sau pe un cip.
Modelarea bolilor
Celulele derivate din PSC de la pacienți sunt utilizate in vitro pentru a recrea patologii specifice. Tipul de celulă specific afectat în patologie se află la baza modelului. De exemplu, motoneuronii sunt folosiți pentru a studia atrofia musculară a coloanei vertebrale (SMA), iar cardiomiocitele sunt utilizate pentru a studia aritmia . Acest lucru poate permite o mai bună înțelegere a patogenezei și dezvoltarea de noi tratamente prin descoperirea medicamentelor. Tipurile de celule imature derivate din PSC pot fi maturate in vitro prin diferite strategii, cum ar fi îmbătrânirea in vitro , pentru a modela boala legată de vârstă in vitro. Bolile majore modelate cu celule derivate din PSC sunt scleroza laterală amiotrofică (SLA), Alzheimer (AD), Parkinson (PD), sindromul X fragil (FXS), boala Huntington (HD), sindromul Down , atrofia musculară spinală (SMA), distrofii musculare , fibroza chistica , sindromul QT lung , și diabet de tip i .
Medicina regenerativă
Sursa potențial nelimitată de celule și țesuturi poate avea o aplicație directă pentru ingineria țesuturilor , înlocuirea celulelor și transplantul după leziuni acute și intervenții chirurgicale reconstructive . Aceste aplicații sunt limitate la tipurile de celule care pot fi diferențiate eficient și în siguranță de PSC umane cu organogeneza adecvată . Organele descelularizate sunt, de asemenea, utilizate ca schelă tisulară pentru organogeneză. Materialul sursă poate fi celule sănătoase normale de la un alt donator (transplant heterolog) sau corectate genetic de la același pacient (autolog). S-au ridicat îngrijorări privind siguranța pacienților datorită posibilității de a contamina celulele nediferențiate. Primul studiu clinic care utilizează celule derivate din hESC a fost în 2011. Primul studiu clinic care utilizează celule derivate din hiPSC a început în 2014 în Japonia.