Hibridizare fluorescentă in situ -Fluorescence in situ hybridization

Vizualizare ARN multiplex în celule folosind teste ViewRNA FISH
O celulă metafazică pozitivă pentru rearanjarea bcr / abl (asociată cu leucemie mielogenă cronică ) folosind FISH. Cromozomii pot fi văzuți în albastru. Cromozomul care este marcat cu pete verzi și roșii (stânga sus) este cel în care este prezentă rearanjarea.

Hibridizarea in situ a fluorescenței ( FISH ) este o tehnică citogenetică moleculară care utilizează sonde fluorescente care se leagă doar de anumite părți ale unei secvențe de acid nucleic cu un grad ridicat de complementaritate a secvenței . Acesta a fost dezvoltat de cercetătorii biomedici la începutul anilor 1980 pentru a detecta și localiza prezența sau absența unor secvențe specifice de ADN pe cromozomi . Microscopia cu fluorescență poate fi utilizată pentru a afla unde sonda fluorescentă este legată de cromozomi. FISH este adesea folosit pentru a găsi caracteristici specifice în ADN pentru a fi utilizate în consiliere genetică , medicină și identificarea speciilor. FISH poate fi, de asemenea, utilizat pentru a detecta și localiza ținte specifice de ARN ( mARN , lncARN și miARN ) în celule, celule tumorale circulante și probe de țesut. În acest context, poate ajuta la definirea modelelor spațio-temporale ale expresiei genelor în celule și țesuturi.

Sonde - ARN și ADN

Detectarea ViewRNA a miR-133 (verde) și miogenină mARN (roșu) în celulele C2C12 diferențiate

În biologie, o sondă este o singură catenă de ADN sau ARN care este complementară unei secvențe de nucleotide de interes.

Sondele ARN pot fi proiectate pentru orice genă sau orice secvență dintr-o genă pentru vizualizarea mARN , lncARN și miARN în țesuturi și celule. FISH este utilizat prin examinarea ciclului de reproducere celulară, în special a interfazei nucleelor ​​pentru orice anomalii cromozomiale. FISH permite analiza unei serii mari de cazuri de arhivă mult mai ușor de identificat cromozomul identificat prin crearea unei sonde cu o fundație cromozomială artificială care va atrage cromozomi similari. Hibridizarea semnalează pentru fiecare sondă atunci când este detectată o anomalie nucleică. Fiecare sondă pentru detectarea ARNm și ARNcn este compusă din ~ 20-50 perechi de oligonucleotide, fiecare pereche acoperind un spațiu de 40-50 bp. Specificul depinde de tehnica FISH utilizată. Pentru detectarea miARN, sondele folosesc chimia de proprietate pentru detectarea specifică a miARN și acoperă întreaga secvență miARN.

Celulele uroteliale marcate cu patru sonde diferite

Sondele sunt adesea derivate din fragmente de ADN care au fost izolate, purificate și amplificate pentru a fi utilizate în Proiectul genomului uman . Mărimea genomului uman este atât de mare, în comparație cu lungimea care ar putea fi secvențiată direct, încât a fost necesar să se împartă genomul în fragmente. (În eventuala analiză, aceste fragmente au fost puse în ordine digerând o copie a fiecărui fragment în fragmente încă mai mici folosind endonucleaze specifice secvenței, măsurând dimensiunea fiecărui fragment mic folosind cromatografia de excludere a dimensiunii și folosind acele informații pentru a determina unde fragmente mari s-au suprapus unele pe altele.) Pentru a păstra fragmentele cu secvențele lor individuale de ADN, fragmentele au fost adăugate într-un sistem de reproducere continuă a populațiilor de bacterii. Populațiile clonale de bacterii, fiecare populație menținând un singur cromozom artificial, sunt stocate în diferite laboratoare din întreaga lume. Cromozomii artificiali ( BAC ) pot fi crescuți, extrși și etichetați, în orice laborator care conține o bibliotecă. Bibliotecile genomice sunt deseori numite după instituția în care au fost dezvoltate. Un exemplu este biblioteca RPCI-11, care poartă numele Centrului de Cancer Comprehensiv Roswell Park (cunoscut anterior ca Roswell Park Cancer Institute) din Buffalo, New York . Aceste fragmente sunt de ordinul a 100 mii de perechi de baze și stau la baza majorității sondelor FISH.

Proces de pregătire și hibridizare - ARN

Celulele, celulele tumorale circulante (CTC) sau secțiunile de țesut încorporat în parafină fixate în formalină (FFPE) sau înghețate sunt fixate, apoi permeabilizate pentru a permite accesibilitatea țintă. FISH a fost, de asemenea, realizat cu succes pe celule nefixate. O sondă specifică țintei, compusă din 20 de perechi de oligonucleotide, hibridizează cu ARN-ul țintă. Sistemele de amplificare a semnalului separate, dar compatibile, permit testarea multiplex (până la două ținte pe test). Amplificarea semnalului se realizează printr-o serie de pași de hibridizare secvențială. La sfârșitul testului, probele de țesut sunt vizualizate la microscopul de fluorescență.

Proces de pregătire și hibridizare - ADN

Schema principiului experimentului FISH pentru localizarea unei gene în nucleu.

În primul rând, se construiește o sondă. Sonda trebuie să fie suficient de mare pentru a se hibridiza în mod specific cu ținta sa, dar nu atât de mare încât să împiedice procesul de hibridizare. Sonda este marcată direct cu fluorofori , cu ținte pentru anticorpi sau cu biotină . Etichetarea se poate face în diferite moduri, cum ar fi translația nick , sau reacția în lanț a polimerazei utilizând nucleotide marcate .

Apoi, se produce o preparare a cromozomului interfazic sau metafazic . Cromozomii sunt fixați ferm de un substrat , de obicei de sticlă. Secvențele repetitive de ADN trebuie blocate prin adăugarea de fragmente scurte de ADN în probă. Sonda este apoi aplicată pe ADN-ul cromozomului și incubată timp de aproximativ 12 ore în timpul hibridizării. Mai multe etape de spălare elimină toate sondele nehibridizate sau parțial hibridizate. Rezultatele sunt apoi vizualizate și cuantificate folosind un microscop capabil să excite colorantul și să înregistreze imagini.

Dacă semnalul fluorescent este slab, poate fi necesară amplificarea semnalului pentru a depăși pragul de detecție al microscopului . Puterea semnalului fluorescent depinde de mulți factori, cum ar fi eficiența etichetării sondei, tipul de sondă și tipul de colorant. Anticorpii etichetați fluorescent sau streptavidina sunt legați de molecula de colorant. Aceste componente secundare sunt selectate astfel încât să aibă un semnal puternic.

Variații privind sondele și analiza

PEȘTUL este o tehnică foarte generală. Diferențele dintre diferitele tehnici FISH se datorează de obicei variațiilor în secvența și etichetarea sondelor; și modul în care sunt utilizate în combinație. Sondele sunt împărțite în două categorii generice: celulare și celulare. În hibridizarea fluorescentă "in situ" se referă la plasarea celulară a sondei

Mărimea sondei este importantă deoarece sondele mai lungi hibridizează mai puțin specific decât sondele mai scurte, astfel încât firele scurte de ADN sau ARN (adesea 10-25 nucleotide) care sunt complementare unei secvențe țintă date sunt adesea folosite pentru a localiza o țintă. Suprapunerea definește rezoluția caracteristicilor detectabile. De exemplu, dacă scopul unui experiment este de a detecta punctul de întrerupere al unei translocații , atunci suprapunerea sondelor - gradul în care o secvență de ADN este conținută în sondele adiacente - definește fereastra minimă în care poate fi detectat punctul de întrerupere .

Amestecul de secvențe de sondă determină tipul de caracteristică pe care sonda o poate detecta. Sondele care hibridizează de-a lungul unui întreg cromozom sunt utilizate pentru a număra numărul unui anumit cromozom, pentru a prezenta translocații sau pentru a identifica fragmente extracromozomale de cromatină . Aceasta se numește adesea „pictură cu cromozomi întregi”. Dacă se utilizează fiecare probă posibilă, fiecare cromozom (întregul genom) ar fi marcat fluorescent, ceea ce nu ar fi deosebit de util pentru determinarea caracteristicilor secvențelor individuale. Cu toate acestea, este posibil să se creeze un amestec de sonde mai mici, care sunt specifice unei anumite regiuni (locus) a ADN-ului; aceste amestecuri sunt utilizate pentru a detecta mutațiile de deleție . Atunci când este combinat cu o culoare specifică, un amestec de sondă specific locus este utilizat pentru a detecta translocații foarte specifice. Amestecuri speciale de sonde specifice locusului sunt adesea folosite pentru a număra cromozomii, prin legarea la regiunile centromerice ale cromozomilor, care sunt suficient de distincte pentru a identifica fiecare cromozom (cu excepția cromozomului 13 , 14 , 21 , 22 ).

O varietate de alte tehnici utilizează amestecuri de sonde de diferite culori. O gamă de culori în amestecuri de coloranți fluorescenți poate fi detectată, astfel încât fiecare cromozom uman poate fi identificat printr-o culoare caracteristică folosind amestecuri de sonde de cromozom întreg și o varietate de raporturi de culori. Deși există mai mulți cromozomi decât culorile de vopsea fluorescente ușor de distins, raporturile amestecurilor de sondă pot fi utilizate pentru a crea culori secundare . Similar cu hibridizarea genomică comparativă , amestecul de sondă pentru culorile secundare este creat prin amestecarea raportului corect dintre două seturi de sonde de culori diferite pentru același cromozom. Această tehnică este uneori numită M-FISH.

Aceeași fizică care face posibilă o varietate de culori pentru M-FISH poate fi utilizată pentru detectarea translocațiilor. Adică, culorile adiacente par să se suprapună; se observă o culoare secundară. Unele teste sunt concepute astfel încât culoarea secundară să fie prezentă sau absentă în cazurile de interes. Un exemplu este detectarea translocațiilor BCR / ABL , unde culoarea secundară indică boala. Această variație se numește adesea FISH cu dublă fuziune sau D-FISH. În situația opusă - în care absența culorii secundare este patologică - este ilustrată printr-un test folosit pentru a investiga translocațiile în care doar unul dintre punctele de întrerupere este cunoscut sau constant. Sondele specifice locusului sunt realizate pentru o parte a punctului de rupere și pentru cealaltă cromozom intact. În celulele normale, culoarea secundară este observată, dar numai culorile primare sunt observate atunci când are loc translocarea. Această tehnică este uneori numită „PEȘT rupt”.

ARN-PEȘ cu o singură moleculă

ARN FISH cu o singură moleculă, cunoscut și sub numele de Stellaris® RNA FISH, este o metodă de detectare și cuantificare a ARNm și a altor molecule lungi de ARN într-un strat subțire de probă de țesut. Țintele pot fi imaginate în mod fiabil prin aplicarea mai multor sonde oligonucleotidice scurte marcate individual . Legarea a până la 48 de oligo fluorescenți marcați la o singură moleculă de ARNm oferă fluorescență suficientă pentru a detecta și localiza cu precizie fiecare ARNm țintă într-o imagine de microscopie fluorescentă cu câmp larg . Sondele care nu se leagă de secvența intenționată nu obțin suficientă fluorescență localizată pentru a se distinge de fundal .

Testele ARN FISH cu o singură moleculă pot fi efectuate în simplex sau multiplex și pot fi utilizate ca experiment de urmărire a PCR cantitativă sau pot fi realizate simultan cu un test de anticorpi fluorescenți . Tehnologia are aplicații potențiale în diagnosticul cancerului , neuroștiința , analiza expresiei genelor și diagnosticul însoțitor .

FISH FISH

Într-o tehnică alternativă la preparatele interfazice sau metafazice, fibrele FISH, cromozomii interfazici sunt atașate la o lamă în așa fel încât să fie întinse pe o linie dreaptă, mai degrabă decât să fie strâns înfășurate, ca în FISH convențional, sau adoptând un teritoriu cromozomic. conformație, ca în interfața FISH. Acest lucru se realizează prin aplicarea forfecării mecanice de -a lungul lungimii lamelei, fie la celulele care au fost fixate la lamela și apoi lizate , fie la o soluție de ADN purificat. O tehnică cunoscută sub numele de pieptănare cromozomială este din ce în ce mai utilizată în acest scop. Conformația extinsă a cromozomilor permite o rezoluție dramatic mai mare - chiar și până la câteva kilobaze . Pregătirea probelor de fibre FISH, deși simplă din punct de vedere conceptual, este o artă destul de calificată și numai laboratoarele specializate folosesc tehnica în mod obișnuit.

Q-PESTE

Articol principal: Q-FISH

Q-FISH combină FISH cu PNA-uri și software de calculator pentru a cuantifica intensitatea fluorescenței. Această tehnică este utilizată în mod obișnuit în cercetarea lungimii telomerilor .

Flux-PEȘTE

Articol principal: Flow-FISH

Flow-FISH folosește citometria de flux pentru a efectua automat FISH folosind măsurători de fluorescență per celulă.

MA-PESTE

FISH asistat de microfluidici ( MA-FISH ) folosește un flux microfluidic pentru a crește eficiența hibridizării ADN-ului, scăzând consumul scump de sondă FISH și pentru a reduce timpul de hibridizare. MA-FISH se aplică pentru detectarea genei HER2 în țesuturile cancerului de sân.

MAR-PESTE

Microautoradiografia FISH este o tehnică de combinare a substraturilor radio-marcate cu FISH convențional pentru a detecta simultan grupuri filogenetice și activități metabolice.

Hybrid Fusion-FISH

Hybrid Fusion FISH ( HF-FISH ) folosește o combinație primară de excitație / emisie aditivă de fluorofori pentru a genera spectre suplimentare printr-un proces de etichetare cunoscut sub numele de transmisie optică dinamică (DOT). Trei fluorofori primari sunt capabili să genereze un total de 7 spectre de emisie ușor detectabile ca rezultat al etichetării combinatorii folosind DOT. Hybrid Fusion FISH permite aplicații FISH foarte multiplexate care sunt vizate în cadrul panourilor de oncologie clinică. Tehnologia oferă o notare mai rapidă cu seturi de probe eficiente care pot fi ușor detectate cu microscopurile fluorescente tradiționale.

Aplicații medicale

Adesea părinții copiilor cu dizabilități de dezvoltare doresc să afle mai multe despre condițiile copilului lor înainte de a alege să aibă un alt copil. Aceste preocupări pot fi abordate prin analiza ADN-ului părinților și al copilului. În cazurile în care dizabilitatea de dezvoltare a copilului nu este înțeleasă, cauza poate fi determinată cu ajutorul FISH și a tehnicilor citogenetice . Exemple de boli care sunt diagnosticate folosind FISH includ sindromul Prader-Willi , sindromul Angelman , sindromul de deleție 22q13 , leucemia mielogenă cronică , leucemia limfoblastică acută , Cri-du-chat , sindromul Velocardiofacial și sindromul Down . FISH pe celulele spermatozoizilor este indicat bărbaților cu cariotip somatic sau meiotic anormal , precum și celor cu oligozoospermie , deoarece aproximativ 50% dintre bărbații oligozoospermici au o rată crescută de anomalii ale cromozomilor spermatozoizilor. Analiza cromozomilor 21, X și Y este suficientă pentru a identifica indivizii oligozoospermici cu risc.

În medicină, FISH poate fi utilizat pentru a forma un diagnostic , pentru a evalua prognosticul sau pentru a evalua remisiunea unei boli, cum ar fi cancerul . Tratamentul poate fi apoi adaptat în mod specific. Un examen tradițional care implică analiza metafazică a cromozomilor este adesea incapabil să identifice trăsăturile care disting o boală de alta, datorită trăsăturilor cromozomiale subtile; PEȘTUL poate elucida aceste diferențe. FISH poate fi, de asemenea, utilizat pentru a detecta celulele bolnave mai ușor decât metodele citogenetice standard , care necesită divizarea celulelor și necesită pregătire manuală și muncă intensă în timp și analiză a lamelor de către un tehnolog. Peștele, pe de altă parte, nu necesită celule vii și poate fi cuantificat automat, un computer numără punctele fluorescente prezente. Cu toate acestea, este necesar un tehnolog instruit pentru a distinge diferențele subtile în modelele de bandă pe cromozomii metafazici îndoiți și răsuciți. FISH poate fi încorporat în dispozitivul microfluidic Lab-on-a-chip . Această tehnologie este încă într-un stadiu de dezvoltare, dar, ca și alte metode de laborator pe un cip, poate duce la tehnici de diagnostic mai portabile.

Această figură prezintă procesul de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) utilizat pentru identificarea agentului patogen. În primul rând, o probă de țesut infectat este preluată de la pacient. Apoi, o oligonucleotidă care este complementară codului genetic al agentului patogen suspectat este sintetizată și etichetată chimic cu o sondă fluorescentă. Proba de țesut colectată trebuie apoi tratată chimic pentru a face membranele celulare permeabile la oligonucleotida marcată fluorescent. După tratarea probei de țesut, se adaugă oligonucleotida complementară marcată. Oligonucleotida marcată fluorescent se va lega doar de ADN-ul complementar al agentului patogen suspectat. Dacă agentul patogen este prezent în proba de țesut, atunci celulele agentului patogen vor străluci / fluoresc după tratamentul cu oligonucleotida marcată. Toate celelalte celule nu vor străluci după tratament.
Proces general de hibridizare fluorescentă in situ (FISH) utilizat pentru identificarea agentului patogen bacterian. În primul rând, o probă de țesut infectat este prelevată de la pacient. Apoi, o oligonucleotidă complementară codului genetic suspectat al agentului patogen este sintetizată și marcată chimic cu o sondă fluorescentă. Proba de țesut este tratată chimic pentru a face membranele celulare permeabile la oligonucleotida marcată fluorescent. Eticheta fluorescentă este apoi adăugată și se leagă doar de ADN-ul complementar al agentului patogen suspectat. Dacă agentul patogen este prezent în proba de țesut, atunci celulele agentului patogen vor fluoresc după tratamentul cu oligonucleotida marcată. Nicio altă celulă nu va străluci.

Identificarea speciilor

FISH a fost studiat pe larg ca o tehnică de diagnostic pentru identificarea agenților patogeni în domeniul microbiologiei medicale. Deși sa dovedit a fi o tehnică utilă și aplicabilă, nu este încă aplicată pe scară largă în laboratoarele de diagnostic. Timpul scurt până la diagnostic (mai puțin de 2 ore) a fost un avantaj major în comparație cu diferențierea biochimică, dar acest avantaj este contestat de MALDI-TOF-MS care permite identificarea unei game mai largi de agenți patogeni în comparație cu tehnicile de diferențiere biochimică. Folosirea FISH în scopuri de diagnostic și-a găsit scopul atunci când este necesară identificarea imediată a speciilor, în special pentru investigarea hemoculturilor pentru care FISH este o tehnică ieftină și ușoară pentru diagnostic rapid preliminar.

FISH poate fi folosit și pentru a compara genomul a două specii biologice , pentru a deduce relații evolutive . O tehnică de hibridizare similară se numește o grădină zoologică . Sondele FISH bacteriene sunt adesea primeri pentru regiunea ARNr 16s .

FISH este utilizat pe scară largă în domeniul ecologiei microbiene , pentru a identifica microorganismele . Biofilmele , de exemplu, sunt compuse din organizații bacteriene complexe (adesea) cu mai multe specii. Pregătirea sondelor ADN pentru o specie și efectuarea FISH cu această sondă permite vizualizarea distribuției acestei specii specifice în biofilm. Pregătirea sondelor (în două culori diferite) pentru două specii permite cercetătorilor să vizualizeze / să studieze co-localizarea acestor două specii în biofilm și poate fi utilă pentru determinarea arhitecturii fine a biofilmului.

Hibridare genomică comparativă

Hibridizarea genomică comparativă poate fi descrisă ca o metodă care utilizează FISH în mod paralel cu comparația puterii de hibridizare pentru a aminti orice perturbări majore în procesul de duplicare a secvențelor ADN din genomul nucleului.

Cariotip virtual

Cariotiparea virtuală este o altă alternativă rentabilă, disponibilă clinic la panourile FISH, utilizând mii până la milioane de sonde pe o singură matrice pentru a detecta modificările numărului de copii, la nivel de genom, la o rezoluție fără precedent. În prezent, acest tip de analiză va detecta doar câștigurile și pierderile de material cromozomial și nu va detecta rearanjări echilibrate, cum ar fi translocațiile și inversiunile, care sunt aberații caracteristice observate în multe tipuri de leucemie și limfom.

Cariotip spectral

Cariotiparea spectrală este o imagine a cromozomilor colorați. Cariotiparea spectrală implică FISH folosirea mai multor forme de mai multe tipuri de sonde, cu rezultatul pentru a vedea fiecare cromozom marcat prin stadiul său de metafază. Acest tip de cariotipare este utilizat în mod specific atunci când se caută aranjamente cromozomiale.

Vezi si

Galerie

  • O altă schemă a procesului FISH.

  • Cip microfluidic care a redus costul pe test al FISH cu 90%.

  • Imagine FISH cu etichetă dublă; Bifidobacterii Cy3, bacterii totale FITC.

  • Paraspeckles vizualizate de FISH cu o singură moleculă împotriva NEAT1 (Quasar 570) în celulele U-2 OS (DAPI).

Referințe

Lecturi suplimentare

linkuri externe