Celule stem induse - Induced stem cells

Celulele stem induse ( iSC ) sunt celule stem derivate din tipuri de celule somatice , reproductive , pluripotente sau de altă natură prin reprogramare deliberată epigenetică . Acestea sunt clasificate fie ca totipotente (iTC), pluripotente (iPSC) sau progenitoare (multipotente - iMSC, numite și celule progenitoare multipotente induse - iMPC) sau unipotente - (iUSC) în funcție de potențialul lor de dezvoltare și de gradul de diferențiere . Progenitorii sunt obținuți prin așa-numita reprogramare directă sau diferențiere direcționată și sunt numiți și celule stem somatice induse .

Trei tehnici sunt recunoscute pe scară largă:

• Transplantul de nuclee prelevate din celule somatice într-un ovocit (celulă de ou) lipsit de propriul nucleu (eliminat în laborator)
• Fuziunea celulelor somatice cu celule stem pluripotente și
• Transformarea celulelor somatice în celule stem, folosind materialul genetic care codifică reprogramarea factorilor proteici , proteine ​​recombinante; microARN, un ARN policistronic sintetic, auto-replicant și substanțe biologic active cu greutate moleculară mică.

Procese naturale

În 1895 Thomas Morgan a îndepărtat unul dintre cele două blastomere ale unei broaște și a constatat că amfibienii sunt capabili să formeze embrioni întregi din partea rămasă. Aceasta a însemnat că celulele își pot schimba calea de diferențiere. În 1924 Spemann și Mangold au demonstrat importanța cheie a inducțiilor celulă-celulă în timpul dezvoltării animalelor. Transformarea reversibilă a celulelor unui tip de celulă diferențiat la altul se numește metaplazie . Această tranziție poate face parte din procesul normal de maturare sau poate fi cauzată de un stimulent.

Un exemplu este transformarea celulelor irisului în celulele lentilei în procesul de maturare și transformare a celulelor epiteliale ale pigmentului retinian în retina neuronală în timpul regenerării la ochii adulți de triton . Acest proces permite organismului să înlocuiască celulele care nu se potrivesc noilor condiții cu celule noi mai potrivite. În discurile imaginale Drosophila , celulele trebuie să aleagă dintr-un număr limitat de stări standard de diferențiere discrete. Faptul că transdeterminarea (schimbarea căii de diferențiere) apare adesea pentru un grup de celule, mai degrabă decât pentru celule unice, arată că aceasta este indusă mai degrabă decât o parte a maturizării.

Cercetătorii au reușit să identifice condițiile minime și factorii care ar fi suficienți pentru a începe cascada proceselor moleculare și celulare pentru a instrui celulele pluripotente să organizeze embrionul . Ei au aratat ca opuse gradiente de os de proteine morfogenetice (BMP) și nodale , doi factor de creștere transformant membri ai familiei , care acționează ca morphogens , sunt suficiente pentru a induce mecanisme moleculare și celulare necesare pentru a organiza, in vivo sau in vitro , celulele neangajate ale zebrafish blastula pol animal într-un embrion bine dezvoltat .

Unele tipuri de celule mature mature, specializate, pot reveni în mod natural la celule stem. De exemplu, celulele „șef” exprimă markerul de celule stem Troy. În timp ce produc în mod normal fluide digestive pentru stomac, ele pot reveni în celule stem pentru a face reparații temporare la leziunile stomacului, cum ar fi o tăietură sau deteriorarea cauzată de infecție. Mai mult, ei pot face această tranziție chiar și în absența unor leziuni vizibile și sunt capabili să completeze unități gastrice întregi, servind în esență ca celule stem „de rezervă” în repaus. Celulele epiteliale ale căilor respiratorii diferențiate pot reveni în celule stem stabile și funcționale in vivo . După rănire, celulele renale maturate diferențiate terminal se diferențiază în versiuni mai primordiale ale lor și apoi se diferențiază în tipurile de celule care necesită înlocuire în țesutul deteriorat Macrofagele se pot reînnoi prin proliferarea locală a celulelor maturate diferențiate. La tritoni, țesutul muscular este regenerat din celule musculare specializate care diferențiază și uită tipul de celulă în care fuseseră. Această capacitate de regenerare nu scade odată cu vârsta și poate fi legată de capacitatea lor de a produce noi celule stem din celule musculare la cerere.

O varietate de celule stem nontumorigenice afișează capacitatea de a genera mai multe tipuri de celule. De exemplu, celulele durabile de stres (Muse) care diferențiază multilineage sunt celule stem adulte umane tolerante la stres care se pot reînnoi. Ele formează grupuri celulare caracteristice în cultură de suspensie care exprimă un set de gene asociate cu pluripotență și se pot diferenția în celule endodermale , ectodermale și mezodermice atât in vitro, cât și in vivo.

Au fost descrise în detaliu alte exemple bine documentate de transdiferențiere și semnificația lor în dezvoltare și regenerare.

Celulele totipotente induse pot fi obținute de obicei prin reprogramarea celulelor somatice prin transfer nuclear cu celule somatice (SCNT).

Celule totipotente induse

Mediat de SCNT

Celulele totipotente induse pot fi obținute prin reprogramarea celulelor somatice cu transfer nuclear cu celule somatice (SCNT). Procesul implică aspirarea nucleului unei celule somatice (corpului) și injectarea acestuia într-un ovocit căruia i s-a eliminat nucleul

Folosind o abordare bazată pe protocolul subliniat de Tachibana și colab., HESC-urile pot fi generate de SCNT folosind nuclei de fibroblaste dermice atât de la un bărbat de 35 de ani, cât și de la un bărbat în vârstă, de 75 de ani, sugerând că vârsta -modificările asociate nu sunt neapărat un impediment pentru reprogramarea nucleară bazată pe SCNT a celulelor umane. O astfel de reprogramare a celulelor somatice într-o stare pluripotentă deține un potențial imens pentru medicina regenerativă . Din păcate, celulele generate de această tehnologie nu sunt potențial protejate complet de sistemul imunitar al pacientului (donator de nuclee), deoarece au același ADN mitocondrial , ca un donator de ovocite, în locul ADN-ului mitocondrial al pacienților. Acest lucru reduce valoarea lor ca sursă pentru terapia autologă de transplant de celule stem ; în ceea ce privește prezentul, nu este clar dacă poate induce un răspuns imun al pacientului la tratament.

Celulele stem embrionare haploide androgenetice induse pot fi utilizate în locul spermei pentru clonare. Aceste celule, sincronizate în faza M și injectate în ovocit, pot produce descendenți viabili.

Aceste evoluții, împreună cu date cu privire la posibilitatea unor ovocite nelimitate din celule stem reproductive mitotice active, oferă posibilitatea producției industriale a animalelor de fermă transgenice. Reclonarea repetată a șoarecilor viabili printr-o metodă SCNT care include un inhibitor al histonei deacetilazei , trichostatina, adăugată la mediul de cultură celulară, arată că poate fi posibilă reclonarea animalelor la nesfârșit, fără acumulări vizibile de reprogramare sau erori genomice. dezvoltarea spermatozoizilor și a celulelor din ou din celulele stem ridică probleme bioetice .

Astfel de tehnologii pot avea, de asemenea, aplicații clinice de anvergură pentru depășirea defectelor citoplasmatice la ovocitele umane. De exemplu, tehnologia ar putea preveni transmiterea bolii moștenite mitocondriale către generațiile viitoare. Materialul genetic mitocondrial este transmis de la mamă la copil. Mutațiile pot provoca diabet, surditate, tulburări oculare, tulburări gastro-intestinale, boli de inimă, demență și alte boli neurologice. Nucleul de la un ou uman a fost transferat la altul, inclusiv mitocondriile sale, creând o celulă care ar putea fi considerată ca având două mame. Ouăle au fost apoi fertilizate, iar celulele stem embrionare rezultate au transportat ADN-ul mitocondrial schimbat. Ca dovadă că tehnica este sigură, autorul acestei metode indică existența maimuțelor sănătoase care au acum mai mult de patru ani - și sunt produsul transplanturilor mitocondriale din diferite medii genetice.

La șoarecii deficienți de telomerază (Terc - / -) de generație târzie , reprogramarea mediată de SCNT atenuează disfuncția telomerilor și defectele mitocondriale într-o măsură mai mare decât reprogramarea bazată pe iPSC.

Au fost descrise alte realizări ale clonării și transformării totipotente.

Obținut fără SCNT

Recent, unii cercetători au reușit să obțină celule totipotente fără ajutorul SCNT. Celulele totipotente au fost obținute utilizând factori epigenetici, cum ar fi izoforma germinală a histonei de ovocite. Reprogramarea in vivo, prin inducerea tranzitorie a celor patru factori Oct4, Sox2, Klf4 și c-Myc la șoareci, conferă caracteristici de totipotență. Injectarea intraperitoneală a acestor celule iPS in vivo genereaza embriofetotoxicitate ca structuri care exprimă (embrionare și extraembryonic trophectodermal ) markere. Potențialul de dezvoltare al celulelor stem pluripotente de șoarece pentru a produce atât descendențe embrionare, cât și extra-embrionare poate fi, de asemenea, extins prin deficitul de microARN miR-34a , ducând la inducerea puternică a retrovirusurilor endogene MuERV-L (MERVL).

Întinerirea la iPSC-uri

Transplantul de celule stem pluripotente / embrionare în corpul mamiferelor adulte duce de obicei la formarea de teratoame , care se pot transforma apoi într-un teratocarcinom tumoral malign. Cu toate acestea, punerea celulelor teratocarcinomului în embrion în stadiul de blastocist a făcut ca acestea să fie încorporate în masa celulară și de multe ori a produs un animal chimeric sănătos normal (adică compus din celule din diferite organisme) animal

iPSc au fost obținute mai întâi sub formă de teratocarcinom transplantabil indus de grefe luate de la embrioni de șoarece. Teratocarcinomul format din celule somatice. Șoarecii mozaic genetic au fost obținuți din celule teratocarcinom maligne, confirmând pluripotența celulelor. S-a dovedit că celulele teratocarcinomului sunt capabile să mențină o cultură de celule stem embrionare pluripotente într-o stare nediferențiată, prin furnizarea mediului de cultură cu diverși factori. În anii 1980, a devenit clar că transplantul de celule stem pluripotente / embrionare în corpul mamiferelor adulte duce de obicei la formarea de teratoame , care se pot transforma apoi într-un teratocarcinom tumoral malign. Cu toate acestea, punerea celulelor teratocarcinomului în embrion în stadiul de blastocist a făcut ca acestea să fie încorporate în masa celulară internă și de multe ori a produs un animal himeric normal (adică compus din celule din diferite organisme) animal. Acest lucru a indicat faptul că cauza teratomului este o disonanță - o comunicare greșită reciprocă între celulele tinere donatoare și celulele adulte din jur (așa-numita „ nișă ” a destinatarului).

În august 2006, cercetătorii japonezi au eludat necesitatea unui ovocit, ca în SCNT. Prin reprogramarea fibroblastelor embrionare de șoarece în celule stem pluripotente prin expresia ectopică a patru factori de transcripție , și anume Oct4 , Sox2 , Klf4 și c-Myc , s-a dovedit că supraexprimarea unui număr mic de factori poate împinge celula spre tranziția către un nou stabil. stare care este asociată cu schimbări în activitatea a mii de gene.

Celulele somatice umane sunt făcute pluripotente prin transducerea lor cu factori care induc pluripotența (OCT 3/4, SOX2, Klf4, c-Myc, NANOG și LIN28). Acest lucru are ca rezultat producerea de celule IPS, care se pot diferenția în orice celulă din cele trei straturi germinale embrionare (Mesoderm, Endoderm, Ectoderm).

Mecanismele de reprogramare sunt astfel legate, mai degrabă decât independente, și sunt centrate pe un număr mic de gene. Proprietățile IPSC sunt foarte asemănătoare cu ESC-urile. S-a demonstrat că iPSC sprijină dezvoltarea șoarecilor cu toate iPSC folosind un embrion tetraploid (4n), cea mai strictă analiză a potențialului de dezvoltare. Cu toate acestea, unele iPSC-uri din punct de vedere genetic nu au reușit să producă șoareci cu toate iPSC-urile din cauza silențierii epigenetice aberante a grupului genei imprimate Dlk1-Dio3 . O echipă condusă de Hans Schöler (care a descoperit gena Oct4 în 1989) a arătat că supraexprimarea Oct4 determină activarea masivă a genei în afara țintei în timpul reprogramării, deteriorând calitatea iPSC-urilor. Comparativ cu OSKM (Oct4, Sox2, Klf4 și c-Myc) care prezintă tipare anormale de imprimare și diferențiere, reprogramarea SKM (Sox2, Klf4 și c-Myc) generează iPSC-uri cu potențial de dezvoltare ridicat (de aproape 20 de ori mai mare decât cel al OSKM) echivalent cu celula stem embrionară , determinată de capacitatea lor de a genera șoareci cu totul iPSC prin complementarea embrionului tetraploid.

Un avantaj important al iPSC față de ESC este că acestea pot fi derivate din celule adulte, mai degrabă decât din embrioni. Prin urmare, devine posibil să se obțină iPSC de la pacienți adulți și chiar vârstnici.

Reprogramarea celulelor somatice în iPSC duce la întinerire. S-a constatat că reprogramarea duce la prelungirea telomerilor și scurtarea ulterioară după diferențierea lor înapoi în derivați asemănători fibroblastelor. Astfel, reprogramarea duce la restabilirea lungimii telomerilor embrionari și, prin urmare, crește numărul potențial de diviziuni celulare altfel limitate de limita Hayflick .

Cu toate acestea, din cauza disonanței dintre celulele întinerite și nișa înconjurătoare a celulelor mai vechi ale destinatarului, injectarea propriului iPSC duce de obicei la un răspuns imun , care poate fi utilizat în scopuri medicale, sau la formarea de tumori precum teratomul. Un motiv ipotezat este că unele celule diferențiate de ESC și iPSC in vivo continuă să sintetizeze izoforme ale proteinelor embrionare . Deci, sistemul imunitar ar putea detecta și ataca celulele care nu cooperează corect.

O moleculă mică numită MitoBloCK-6 poate forța celulele stem pluripotente să moară declanșând apoptoza (prin eliberarea citocromului c prin membrana exterioară mitocondrială ) în celulele stem pluripotente umane, dar nu și în celulele diferențiate. La scurt timp după diferențiere, celulele fiice au devenit rezistente la moarte. Când MitoBloCK-6 a fost introdus în linii celulare diferențiate, celulele au rămas sănătoase. Se presupune că cheia supraviețuirii lor se datorează schimbărilor suferite de mitocondriile pluripotente ale celulelor stem în procesul de diferențiere celulară. Această capacitate a MitoBloCK-6 de a separa liniile celulare pluripotente și diferențiate are potențialul de a reduce riscul de teratoame și alte probleme în medicina regenerativă.

În 2012, au fost identificate alte molecule mici (inhibitori citotoxici selectivi ai celulelor stem pluripotente umane - hPSC) care au împiedicat celulele stem pluripotente umane să formeze teratoame la șoareci. Compusul cel mai puternic și selectiv dintre aceștia (PluriSIn # 1) inhibă stearoil-coA desaturaza (enzima cheie în biosinteza acidului oleic ), care duce în cele din urmă la apoptoză. Cu ajutorul acestei molecule, celulele nediferențiate pot fi îndepărtate selectiv din cultură. O strategie eficientă pentru eliminarea selectivă a celulelor pluripotente cu potențial de teratom vizează factorii (factorii) antiapoptotici specifici celulelor stem pluripotenți (de exemplu, survivin sau Bcl10). Un singur tratament cu inhibitori chimici ai supraviețuirii (de exemplu, quercetina sau YM155) poate induce moartea selectivă și completă a celulelor hPSC nediferențiate și se pretinde a fi suficient pentru a preveni formarea teratomului după transplant. Cu toate acestea, este puțin probabil ca orice tip de autorizare preliminară să poată asigura replantarea iPSC-urilor sau ESC-urilor. După îndepărtarea selectivă a celulelor pluripotente, acestea reapar emerge rapid prin întoarcerea celulelor diferențiate în celule stem, ceea ce duce la apariția tumorilor. Acest lucru se poate datora tulburării reglării let-7 a țintei Nr6a1 (cunoscut și ca factor nuclear al celulelor germinale - GCNF), un represor transcripțional embrionar al genelor pluripotenței care reglează expresia genelor la fibroblastele adulți în urma pierderii de miARN de micro-ARN .

Formarea teratomului de către celulele stem pluripotente poate fi cauzată de activitatea scăzută a enzimei PTEN , raportată pentru a promova supraviețuirea unei populații mici (0,1-5% din populația totală) de celule carcinom embrionare asemănătoare embrionului, care inițiază teratom, foarte tumorigen, agresive. . Supraviețuirea acestor celule care inițiază teratomul este asociată cu reprimarea eșuată a Nanog , precum și cu o înclinație pentru metabolismul crescut al glucozei și al colesterolului. Aceste celule care inițiază teratomul au exprimat, de asemenea, un raport mai mic de p53 / p21 în comparație cu celulele non-tumorigene. În legătură cu problemele de siguranță de mai sus, utilizarea iPSC-urilor pentru terapia celulară este încă limitată. Cu toate acestea, ele pot fi utilizate pentru o varietate de alte scopuri, inclusiv modelarea bolii, screening-ul (selecția selectivă) a medicamentelor și testarea toxicității diferitelor medicamente.

Modulatoare de molecule mici ale destinului celulelor stem.

Țesutul crescut din iPSC, plasat în embrionii „himerici” în stadiile incipiente ale dezvoltării șoarecilor, practic nu provoacă un răspuns imun (după ce embrionii au crescut în șoareci adulți) și sunt potriviți pentru transplant autolog În același timp, complet reprogramarea celulelor adulte in vivo în țesuturi prin inducerea tranzitorie a celor patru factori Oct4, Sox2, Klf4 și c-Myc la șoareci are ca rezultat teratoame care apar din mai multe organe. Mai mult, reprogramarea parțială a celulelor către pluripotență in vivo la șoareci demonstrează că reprogramarea incompletă implică modificări epigenetice (reprimarea nereușită a țintelor Polycomb și modificarea metilării ADN ) în celulele care determină dezvoltarea cancerului. Cu toate acestea, mai mulți cercetători au reușit ulterior să efectueze reprogramarea parțială ciclică in vivo prin exprimarea factorilor Yamanaka pentru o perioadă scurtă de timp, fără carcinogeneză ulterioară, întinerind astfel parțial și extinzând durata de viață la șoarecii progeroizi. Cu metoda in vitro care folosește perioade puțin mai lungi de reprogramare (pentru a întineri substanțial) celulele își pierd temporar identitatea celulară, dar „își recapătă soarta somatică inițială atunci când factorii de reprogramare sunt retrași”.

Exemplu de cultură celulară a unei molecule mici ca instrument în loc de proteină. în cultura de celule pentru a obține o descendență pancreatice de la mesodermal celule stem de acid retinoic trebuie activat calea de semnalizare în timp ce ariciul sonic cale este inhibată, ceea ce se poate face prin adăugarea la mass - media anti-Sst anticorpi , proteine care interacționează Arici sau ciclopamina - primul două sunt proteine, iar ultima o moleculă mică.

Stimulare chimică

Folosind doar molecule mici , Deng Hongkui și colegii săi au demonstrat că endogenele „gene master” sunt suficiente pentru reprogramarea destinului celular. Ei au indus o stare pluripotentă în celulele adulte de la șoareci folosind șapte compuși cu molecule mici. Eficacitatea metodei este destul de ridicată: a reușit să convertească 0,02% din celulele țesutului adult în iPSC, ceea ce este comparabil cu rata de conversie a inserției genetice. Autorii notează că șoarecii generați din CiPSC au fost „100% viabile și aparent sănătoși timp de până la 6 luni”. Deci, această strategie de reprogramare chimică are o utilizare potențială în generarea tipurilor de celule funcționale de dorit pentru aplicații clinice.

În 2015 a fost stabilit un sistem robust de reprogramare chimică cu un randament de până la 1.000 de ori mai mare decât cel al protocolului raportat anterior. Deci, reprogramarea chimică a devenit o abordare promițătoare pentru manipularea destinelor celulare.

Diferențierea de teratomul indus

Faptul că iPSC-urile umane sunt capabile să formeze teratoame nu numai la oameni, ci și la unele corpuri de animale, în special șoareci sau porci, le-a permis cercetătorilor să dezvolte o metodă de diferențiere a iPSC-urilor in vivo. În acest scop, iPSC-urile cu un agent pentru inducerea diferențierii în celulele țintă sunt injectate la un porc sau șoarece modificat genetic care a suprimat activarea sistemului imunitar pe celulele umane. Teratomul format este decupat și utilizat pentru izolarea celulelor umane diferențiate necesare prin intermediul anticorpului monoclonal împotriva markerilor specifici țesutului de pe suprafața acestor celule. Această metodă a fost utilizată cu succes pentru producerea de celule umane funcționale mieloide, eritroide și limfoide adecvate pentru transplant (dar numai la șoareci). Șoarecii croiți cu celule hematopoietice derivate de teratomul iPSC uman au produs celule B și T umane capabile de răspunsuri imune funcționale. Aceste rezultate oferă speranța că generarea in vivo a celulelor personalizate ale pacienților este fezabilă, oferind materiale care ar putea fi utile pentru transplant, generarea de anticorpi umani și aplicații de screening pentru medicamente. Folosind MitoBloCK-6 și / sau PluriSIn # 1, celulele progenitoare diferențiate pot fi purificate în continuare din teratom formând celule pluripotente. Faptul că diferențierea are loc chiar și în nișa teratomului oferă speranța că celulele rezultate sunt suficient de stabile pentru stimuli capabili să provoace trecerea lor înapoi la starea diferențiată (pluripotentă) și, prin urmare, sigure. Un sistem similar de diferențiere in vivo, care produce celule stem hematopoietice ingerabile de la șoareci și umane iPSC la animale purtătoare de teratom în combinație cu o manevră pentru a facilita hematopoieza, a fost descris de Suzuki și colab. Ei au observat că nici leucemie, nici tumori nu au fost observate la destinatari după injectarea intravenoasă de celule stem hematopoietice derivate din iPSC în destinatarii iradiați. Mai mult, această injecție a dus la reconstituirea multiliniară și pe termen lung a sistemului hematolimopoietic în transferuri seriale. Un astfel de sistem oferă un instrument util pentru aplicarea practică a iPSC-urilor în tratamentul bolilor hematologice și imunologice.

Pentru dezvoltarea ulterioară a acestei metode, animalele (cum ar fi șoarecii) în care se cultivă grefa de celule umane trebuie să aibă genom modificat astfel încât toate celulele sale să exprime și să aibă la suprafață SIRPα uman . Pentru a preveni respingerea după transplant la pacient a organului sau țesutului alogen, crescut din celule stem pluripotente in vivo la animal, aceste celule ar trebui să exprime două molecule: CTLA4-Ig , care perturbă căile costimulatoare ale celulelor T și PD-L1 , care activează calea inhibitoare a celulelor T.

A se vedea, de asemenea: brevetul US 20130058900  .

Tipuri de celule diferențiate

Celulele retiniene

În viitorul apropiat, vor începe studiile clinice concepute pentru a demonstra siguranța utilizării iPSC-urilor pentru terapia celulară a persoanelor cu degenerescență maculară legată de vârstă, o boală care provoacă orbire prin deteriorarea retinei. Există mai multe articole care descriu metodele de producere a celulelor retiniene din iPSC-uri și cum să le utilizați pentru terapia celulară. Rapoartele despre transplantul de epiteliu pigmentar retinian derivat din iPSC au arătat comportamente vizuale îmbunătățite ale animalelor experimentale timp de 6 săptămâni după transplant. Cu toate acestea, studiile clinice au avut succes: zece pacienți care suferă de retinită pigmentară au restaurat vederea, inclusiv o femeie căreia i-au rămas doar 17% din vedere.

Celulele epiteliale ale plămânului și ale căilor respiratorii

Boli pulmonare cronice, cum ar fi fibroza pulmonară idiopatică și fibroza chistică sau boala pulmonară obstructivă cronică și astmul , sunt principalele cauze de morbiditate și mortalitate la nivel mondial, cu o povară umană, societală și financiară considerabilă. Prin urmare, există o nevoie urgentă de terapie celulară eficientă și de inginerie a țesuturilor pulmonare . Au fost dezvoltate mai multe protocoale pentru generarea majorității tipurilor de celule ale sistemului respirator , care pot fi utile pentru obținerea celulelor terapeutice specifice pacientului.

Celulele reproductive

Unele linii de iPSC au potențialul de a se diferenția în celule germinale masculine și celule asemănătoare ovocitelor într-o nișă adecvată (prin cultivarea în acid retinoic și mediu de diferențiere a fluidului folicular porcin sau transplant de tubuli seminiferi). Mai mult, transplantul iPSC contribuie la repararea testiculului șoarecilor infertili, demonstrând potențialul derivării gametilor de la iPSC in vivo și in vitro.

Celule stem progenitoare induse

Transdiferențierea directă

Riscul de cancer și tumori creează nevoia de a dezvolta metode pentru linii celulare mai sigure, adecvate pentru utilizare clinică. O abordare alternativă este așa-numita „reprogramare directă” - transdiferențierea celulelor fără a trece prin starea pluripotentă. Baza acestei abordări a fost că 5-azacitidina - un reactiv de demetilare a ADN - poate provoca formarea de clone miogene , condrogenice și adipogeni într-o linie celulară nemuritoare de fibroblaste embrionare de șoarece și că activarea unei singure gene, numită ulterior MyoD1, este suficient pentru o astfel de reprogramare. Comparativ cu iPSC-urile a căror reprogramare necesită cel puțin două săptămâni, formarea celulelor progenitoare induse apare uneori în câteva zile, iar eficiența reprogramării este de obicei de multe ori mai mare. Această reprogramare nu necesită întotdeauna divizarea celulelor. Celulele rezultate în urma unei astfel de reprogramări sunt mai potrivite pentru terapia celulară, deoarece nu formează teratoame. De exemplu, Chandrakanthan și colab., Și Pimanda descriu generarea de celule stem multipotente regenerative de țesuturi (celule iMS) prin tratarea tranzitorie a celulelor osoase și grase maturi cu un factor de creștere (factor de creștere derivat din trombocite –AB (PDGF-AB)) și 5-azacididină. Acești autori afirmă că „Spre deosebire de celulele stem mezenchimale primare, care sunt utilizate cu puține dovezi obiective în practica clinică pentru a promova repararea țesuturilor, celulele iMS contribuie direct la regenerarea țesuturilor in vivo într-o manieră dependentă de context, fără a forma tumori” și astfel „are semnificative domeniul de aplicare pentru regenerarea țesuturilor ".

Transdiferențierea factorului de transcripție unică

Inițial, numai celulele embrionare timpurii puteau fi aduse în schimbarea identității lor. Celulele mature sunt rezistente la schimbarea identității lor odată ce s-au angajat pentru un anumit tip. Cu toate acestea, expresia succintă a unui singur factor de transcripție, factorul ELT-7 GATA, poate converti identitatea celulelor neendodermice specializate complet diferențiate ale faringelui în celule intestinale complet diferențiate în larvele intacte și viermi rotunzi adulți Caenorhabditis elegans, fără necesitate de un intermediar diferențiat.

Transdiferențierea cu activator mediat de CRISPR

Soarta celulei poate fi manipulată în mod eficient prin editarea epigenomului , în special prin activarea directă a expresiei genice specifice endogene cu activator mediat CRISPR . Când dCas9 (care a fost modificat astfel încât să nu mai taie ADN-ul, dar totuși poate fi ghidat către secvențe specifice și să se lege de acestea) este combinat cu activatori de transcripție, poate manipula cu precizie expresia genelor endogene. Folosind această metodă, Wei și colab., Au îmbunătățit expresia genelor endogene Cdx2 și Gata6 de către activatorii mediați de CRISPR, transformând astfel celulele stem embrionare de șoarece în două linii extraembrionare, adică celule stem tipice trofoblaste și celule endodermice extraembrionare. O abordare analogă a fost utilizată pentru a induce activarea genelor endogene Brn2, Ascl1 și Myt1l pentru a converti fibroblastele embrionare de șoarece în celule neuronale induse. Astfel, activarea transcripțională și remodelarea epigenetică a factorilor endogeni de transcripție masteră sunt suficiente pentru conversia între tipurile de celule. Activarea rapidă și susținută a genelor endogene în contextul lor de cromatină nativă prin această abordare poate facilita reprogramarea cu metode tranzitorii care evită integrarea genomică și oferă o nouă strategie pentru depășirea barierelor epigenetice în calea specificației destinului celular.

Regenerarea modelării fazei procesului

Un alt mod de reprogramare este simularea proceselor care au loc în timpul regenerării membrelor amfibiene . La amfibienii urodeli , un pas timpuriu în regenerarea membrelor este dediferențierea fibrelor musculare scheletice într-o celulă care proliferează în țesutul membrelor. Cu toate acestea, tratamentul secvențial cu molecule mici al fibrei musculare cu miozerină, reversină ( inhibitorul kinazei aurorei B ) și alte substanțe chimice (BIO (inhibitor glicogen sintază-3 kinază), acid lizofosfatidic (activator pleiotrop al receptorilor cuplați cu proteina G) , SB203580 ( inhibitor p38 MAP kinază ) sau SQ22536 (inhibitor adenilil ciclază)) determină formarea de noi tipuri de celule musculare, precum și alte tipuri de celule, cum ar fi precursorii celulelor grase, osoase și ale sistemului nervos.

Transdiferențierea bazată pe anticorpi

Cercetătorii au descoperit că anticorpul care imită GCSF poate activa un receptor care stimulează creșterea pe celulele măduvei într-un mod care induce celulele stem ale măduvei, care în mod normal se dezvoltă în celule albe din sânge pentru a deveni celule progenitoare neuronale. Tehnica permite cercetătorilor să caute biblioteci mari de anticorpi și să le selecteze rapid pe cele cu efect biologic dorit.

Reprogramarea de către bacterii

Tractul gastrointestinal uman este colonizat de o vastă comunitate de simbionți și comensale. Cercetătorii demonstrează fenomenul reprogramării celulelor somatice de către bacterii și generării de celule multipotențiale din celulele fibroblaste dermice umane adulte prin încorporarea bacteriilor lactice. care poate induce stres ribozomal și stimula plasticitatea dezvoltării celulare ".

Celule reprogramate condiționat

Schlegel și Liu au demonstrat că combinația de celule alimentatoare și un inhibitor de kinază Rho (Y-27632) induce celule epiteliale normale și tumorale din multe țesuturi să prolifereze pe termen nelimitat in vitro. Acest proces are loc fără a fi necesară transducția genelor virale sau celulare exogene. Aceste celule au fost denumite „celule reprogramate condiționat (CRC)”. Inducerea CRC este rapidă și rezultă din reprogramarea întregii populații de celule. CRC-urile nu exprimă niveluri ridicate de proteine ​​caracteristice iPSC-urilor sau celulelor stem embrionare (ESC) (de exemplu, Sox2, Oct4, Nanog sau Klf4). Această inducție a CRC este reversibilă, iar îndepărtarea Y-27632 și a alimentatoarelor permite diferențierea normală a celulelor. Tehnologia CRC poate genera 2 x 10 ⁶ celule în 5 până la 6 zile de la biopsii cu ac și poate genera culturi din tesutul crioconservate si de la mai puțin de patru celule viabile. CRC-urile păstrează un cariotip normal și rămân nontumorigenice. Această tehnică stabilește, de asemenea, în mod eficient culturi celulare din tumori umane și de rozătoare.

Capacitatea de a genera rapid multe celule tumorale din specimene mici de biopsie și țesut înghețat oferă oportunități semnificative pentru diagnosticare și terapie pe bază de celule (inclusiv testarea chemosensibilității) și extinde în mare măsură valoarea biobăncii. Folosind tehnologia CRC, cercetătorii au reușit să identifice o terapie eficientă pentru un pacient cu un tip rar de tumoare pulmonară. Grupul Engleman descrie o platformă farmacogenomică care facilitează descoperirea rapidă a combinațiilor de medicamente care pot depăși rezistența utilizând sistemul CRC. În plus, metoda CRC permite manipularea genetică a celulelor epiteliale ex vivo și evaluarea lor ulterioară in vivo în aceeași gazdă. În timp ce studiile inițiale au arătat că co-cultivarea celulelor epiteliale cu celulele elvețiene 3T3 J2 a fost esențială pentru inducerea CRC, cu plăci de cultură transwell, contactul fizic între alimentatoare și celulele epiteliale nu este necesar pentru inducerea CRC și, mai important, iradierea celulelor alimentatoare este necesară pentru această inducție. În concordanță cu experimentele transwell, mediul condiționat induce și menține CRC, care este însoțit de o creștere concomitentă a activității telomerazei celulare. Activitatea mediului condiționat se corelează direct cu apoptoza celulei feeder induse de radiații. Astfel, reprogramarea condiționată a celulelor epiteliale este mediată de o combinație de Y-27632 și de un factor (i) solubil eliberat de celulele de alimentare apoptotice.

Riegel și colab. demonstrează că celulele ME de șoarece, izolate de glandele mamare normale sau de tumorile mamare induse de virusul tumorilor mamare de șoarece (MMTV) -Neu, pot fi cultivate la nesfârșit ca celule reprogramate condiționat (CRC). Markerii asociați cu progenitorii suprafeței celulare sunt induși rapid în ME-CRC-urile normale de șoarece în raport cu celulele ME. Cu toate acestea, expresia anumitor subpopulații progenitoare mamare, cum ar fi CD49f + ESA + CD44 +, scade semnificativ în pasajele ulterioare. Cu toate acestea, ME-CRC de șoarece crescute într-o matrice extracelulară tridimensională au dat naștere unor structuri acinare mamare. ME-CRC izolate din tumorile mamare transgenice de șoarece MMTV-Neu exprimă niveluri ridicate de HER2 / neu, precum și markeri celulari care inițiază tumori, cum ar fi CD44 +, CD49f + și ESA + (EpCam). Aceste tipare de expresie sunt susținute în pasaje CRC ulterioare. ME-CRC de trecere timpurie și tardivă din tumorile MMTV-Neu care au fost implantate în plăcuțele de grăsime mamară ale șoarecilor simgenici sau goi au dezvoltat tumori vasculare care s-au metastazat în decurs de 6 săptămâni de la transplant. Important, histopatologia acestor tumori nu se distinge de cea a tumorilor parentale care se dezvoltă la șoarecii MMTV-Neu. Aplicarea sistemului CRC la celulele epiteliale mamare de șoarece oferă un model atractiv pentru a studia genetica și fenotipul epiteliului normal și transformat de șoarece într-un mediu de cultură definit și în studii de transplant in vivo.

O abordare diferită a CRC este de a inhiba CD47 - o proteină de membrană care este receptorul trombospondinei-1 . Pierderea CD47 permite proliferarea susținută a celulelor endoteliale murine primare , crește diviziunea asimetrică și permite acestor celule să reprogrameze spontan pentru a forma clustere multipotente asemănătoare corpului . Knockdown CD47 crește în mod acut nivelurile de ARNm de c-Myc și alți factori de transcripție a celulelor stem din celulele in vitro și in vivo. Trombospondina-1 este un semnal cheie de mediu care inhibă auto-reînnoirea celulelor stem prin CD47. Astfel, antagoniștii CD47 permit auto-reînnoirea și reprogramarea celulelor prin depășirea reglării negative a c-Myc și a altor factori de transcripție a celulelor stem. Blocarea in vivo a CD47 folosind un morfolin antisens crește supraviețuirea șoarecilor expuși la iradiere totală corporală letală datorită capacității proliferative crescute a celulelor derivate din măduva osoasă și radioprotecției țesuturilor gastrointestinale radiosensibile.

Amelioratori specifici liniei

Macrofagele diferențiate se pot reînnoi în țesuturi și se pot extinde pe termen lung în cultură. În anumite condiții, macrofagele se pot împărți fără a pierde caracteristicile pe care le-au dobândit în timp ce se specializează în celule imune - ceea ce de obicei nu este posibil cu celulele diferențiate . Macrofagele realizează acest lucru prin activarea unei rețele genetice similare cu cea găsită în celulele stem embrionare. Analiza cu o singură celulă a dezvăluit că, in vivo , macrofagele proliferante pot dereprima un repertoriu amplificator specific macrofagelor asociat cu o rețea genică care controlează auto-reînnoirea. Acest lucru s-a întâmplat atunci când concentrațiile a doi factori de transcripție numiți MafB și c-Maf au fost în mod natural scăzute sau au fost inhibate pentru o perioadă scurtă de timp. Manipulările genetice care au oprit MafB și c-Maf în macrofage au determinat celulele să înceapă un program de auto-reînnoire. Rețeaua similară controlează, de asemenea, auto-reînnoirea celulelor stem embrionare, dar este asociată cu amelioratori specifici specifici celulelor stem embrionare.

Prin urmare, macrofagele izolate din șoarecii cu deficiență dublă de MafB și c-Maf se împart la nesfârșit; autoînnoirea depinde de c-Myc și Klf4 .

Conversia descendenței indirecte

Conversia indirectă a liniei este o metodologie de reprogramare în care celulele somatice trec printr-o stare intermediară plastică a celulelor parțial reprogramate (pre-iPSC), indusă de expunerea scurtă la factorii de reprogramare, urmată de diferențierea într-un mediu chimic special dezvoltat (nișă artificială).

Această metodă ar putea fi atât mai eficientă, cât și mai sigură, deoarece nu pare să producă tumori sau alte modificări genetice nedorite și are ca rezultat un randament mult mai mare decât alte metode. Cu toate acestea, siguranța acestor celule rămâne discutabilă. Deoarece conversia descendenței din pre-iPSC se bazează pe utilizarea condițiilor de reprogramare iPSC, o fracțiune din celule ar putea dobândi proprietăți pluripotente dacă nu opresc procesul de diferențiere in vitro sau datorită diferențierii ulterioare in vivo.

Glicoproteina membranei externe

O caracteristică comună a celulelor stem pluripotente este natura specifică a glicozilării proteinelor a membranei lor exterioare. Acest lucru le distinge de majoritatea celulelor nepluripotente, deși nu de celulele albe din sânge . Cele glicani de pe suprafața celulelor stem răspunde rapid la modificări în starea celulară și de semnalizare și sunt , prin urmare , ideale pentru a identifica chiar schimbări minore în populațiile de celule. Mulți markeri ai celulelor stem se bazează pe epitopii glicanului de la suprafața celulei, inclusiv markerii utilizați pe scară largă SSEA-3 , SSEA-4, Tra 1-60 și Tra 1-81. Suila Heli și colab. speculează că în celulele stem umane, O-GlcNAc extracelular și extracelular O-LacNAc joacă un rol crucial în reglarea fină a căii de semnalizare Notch - un sistem de semnalizare celulară extrem de conservat care reglează specificația destinului celulei, diferențierea, asimetria stânga-dreapta, apoptoza, somitogeneza și angiogeneza și joacă un rol cheie în proliferarea celulelor stem (revizuite de Perdigoto și Bardin și Jafar-Nejad și colab.)

Modificările glicozilării proteinei membranei externe sunt markeri ai stărilor celulare legate într-un fel cu pluripotența și diferențierea. Schimbarea glicozilării este aparent nu doar rezultatul inițializării expresiei genelor, ci are și un rol important de regulator al genei implicat în achiziționarea și menținerea stării nediferențiate.

De exemplu, activarea glicoproteinei ACA, care leagă glicozilfosfatidilinozitolul pe suprafața celulelor progenitoare din sângele periferic uman induce o expresie crescută a genelor Wnt , Notch-1 , BMI1 și HOXB4 printr-o cascadă de semnalizare PI3K / Akt / mTor / PTEN și promovează formarea a unei populații autoînnoitoare de celule stem hematopoietice.

Mai mult, diferențierea celulelor progenitoare indusă de calea de semnalizare dependentă de ACA duce la celule stem pluripotente induse de ACA, capabile să diferențieze in vitro în celule ale celor trei straturi germinale . Studiul capacității lectinelor de a menține o cultură de celule stem pluripotente umane a condus la descoperirea lectinei Erythrina crista-galli (ECA), care poate servi ca o matrice simplă și extrem de eficientă pentru cultivarea celulelor stem pluripotente umane.

Reprogramarea cu un proteoglican

O strategie alternativă pentru a converti celulele somatice în stări pluripotente poate fi stimularea continuă a fibroblastelor de către un singur proteoglican ECM , fibromodulina . Astfel de celule prezintă capacitatea de regenerare a mușchilor scheletici cu risc tumorigenic semnificativ mai mic în comparație cu iPSC-urile. Scăderea tumorigenicității acestor celule este legată de reglarea ascendentă a CDKN2B în timpul procesului de reprogramare recombinantă a fibromodulinei umane

Reprogramarea printr-o abordare fizică

Proteina de adeziune celulară E-cadherina este indispensabilă pentru un fenotip pluripotent robust . În timpul reprogramării pentru generarea de celule iPS, N-cadherina poate înlocui funcția E-cadherinei. Aceste funcții ale caderinelor nu sunt direct legate de aderență, deoarece morfologia sferei ajută la menținerea „stemness” a celulelor stem. Mai mult, formarea sferei, datorită creșterii forțate a celulelor pe o suprafață de atașament scăzută, induce uneori reprogramarea. De exemplu, celulele progenitoare neuronale pot fi generate din fibroblaste direct printr-o abordare fizică fără a introduce factori de reprogramare exogeni.

Indicii fizici, sub formă de microgroove paralele pe suprafața substraturilor adezive celulare, pot înlocui efectele modificatorilor epigenetici cu molecule mici și pot îmbunătăți semnificativ eficiența reprogramării. Mecanismul se bazează pe mecanomodularea stării epigenetice a celulelor. Mai exact, „scăderea activității histonei deacetilazei și reglarea în sus a expresiei domeniului de repetare WD 5 (WDR5) - o subunitate a H3 metiltranferazei - prin suprafețe microgroase duc la creșterea acetilării și metilării histonei H3”. Schelele nanofibre cu orientarea fibrelor aliniate produc efecte similare cu cele produse de microgroove, sugerând că modificările morfologiei celulare pot fi responsabile pentru modularea stării epigenetice.

Rolul aderențelor celulare în dezvoltarea neuronală . Imagine oferită de utilizatorul Wikipedia JWSchmidt sub GNU Free Documentation License

Rigiditatea substratului este un indiciu biofizic important care influențează inducția neuronală și specificația subtipului. De exemplu, substraturile moi favorizează conversia neuroepitelială, inhibând în același timp diferențierea crestei neuronale a hESC-urilor într-o manieră dependentă de BMP4 . Studiile mecaniciste au relevat un proces mecanotransductiv multi-țintit care implică fosforilarea Smad mecanosensibilă și transferul nucleocitoplasmatic, reglementat de activitățile Hippo / YAP dependente de rigiditate și de integritatea și contractilitatea citoscheletului actomiozinei .

Celulele stem embrionare de șoarece (mESC) suferă auto-reînnoire în prezența factorului inhibitor al leucemiei citokinei (LIF). După retragerea LIF, mESC-urile se diferențiază, însoțite de o creștere a aderenței celule-substrat și a răspândirii celulare. Răspândirea celulară restricționată în absența LIF fie prin cultivarea mESC pe biosubstraturi slab adezivi definite chimic, fie prin manipularea citoscheletului , a permis celulelor să rămână într-o stare nediferențiată și pluripotentă. Efectul răspândirii celulare restricționate asupra autoînnoirii mESC nu este mediat de aderența intercelulară crescută, deoarece inhibarea aderenței mESC utilizând o funcție care blochează anticorpul anti-E-cadherin sau siRNA nu favorizează diferențierea. Au fost descrise posibile mecanisme ale predeterminării destinului celulelor stem prin interacțiuni fizice cu matricea extracelulară.

A fost dezvoltată o nouă metodă care transformă celulele în celule stem mai rapid și mai eficient prin „stoarcere” a acestora folosind rigiditatea și densitatea micro-mediului 3D a gelului din jur. Tehnica poate fi aplicată unui număr mare de celule pentru a produce celule stem în scopuri medicale la scară industrială.

Celulele implicate în procesul de reprogramare se schimbă morfologic pe măsură ce procesul se desfășoară. Acest lucru duce la diferențe fizice în forțele adezive între celule. Diferențe substanțiale în „semnătura adezivă” între celulele stem pluripotente, celulele parțial reprogramate, descendența diferențiată și celulele somatice au permis dezvoltarea procesului de separare pentru izolarea celulelor stem pluripotente în dispozitivele microfluidice , care este:

1. rapid (separarea durează mai puțin de 10 minute);
2. eficient (separarea are ca rezultat o cultură de celule iPS pură mai mare de 95%);
3. inofensiv (rata de supraviețuire a celulelor este mai mare de 80% și celulele rezultate păstrează profiluri transcripționale normale, potențial de diferențiere și cariotip).

Celulele stem posedă memorie mecanică (își amintesc semnalele fizice din trecut) - cu factorii căii de semnalizare Hippo : proteina asociată cu Da (YAP) și coactivator transcripțional cu domeniu de legare PDZ (TAZ) care acționează ca un reostat mecanic intracelular - care stochează informații din trecut medii fizice și influențează soarta celulelor.

Celulele stem neuronale

Accidentul vascular cerebral și multe tulburări neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson, boala Alzheimer și scleroza laterală amiotrofică, necesită terapii de înlocuire a celulelor. Utilizarea cu succes a celulelor neuronale convertite (CN) în transplanturi deschide o nouă cale de a trata astfel de boli. Cu toate acestea, neuronii induși (iN) convertiți direct din fibroblasti sunt angajați în mod terminal și prezintă o capacitate proliferativă foarte limitată, care ar putea să nu furnizeze suficiente celule donatoare autologe pentru transplant. Celulele stem neuronale induse de auto-reînnoire (iNSC) oferă avantaje suplimentare față de iN atât pentru cercetarea de bază, cât și pentru aplicațiile clinice.

De exemplu, în condiții specifice de creștere, fibroblastele șoarecilor pot fi reprogramate cu un singur factor, Sox2, pentru a forma iNSC-uri care se reînnoiesc în cultură și după transplant și pot supraviețui și se pot integra fără a forma tumori în creierul șoarecilor. INSC-urile pot fi derivate din fibroblaste umane adulte prin tehnici non-virale, oferind astfel o metodă sigură pentru transplantul autolog sau pentru dezvoltarea de modele de boli pe bază de celule.

Celulele progenitoare neuronale induse chimic (ciNPC) pot fi generate din fibroblaste de la coada șoarecelui și celule somatice urinare umane fără a introduce factori exogeni, dar - printr-un cocktail chimic, și anume VCR (V, VPA , un inhibitor al HDAC ; C, CHIR99021, un inhibitor al kinazelor GSK-3 și R, RepSox , un inhibitor al căilor de semnalizare beta TGF ), în condiții hipoxice fiziologice . Cocktailuri alternative cu inhibitori ai deacetilării histonice, glicogen sintază kinază și căi TGF-β (unde: butiratul de sodiu (NaB) sau Trichostatin A (TSA) ar putea înlocui VPA, clorura de litiu (LiCl) sau carbonatul de litiu (Li2CO3) ar putea înlocui CHIR99021 sau Repsox poate fi înlocuit cu SB-431542 sau tranilast ) prezintă eficacități similare pentru inducerea ciNPC. Zhang și colab., Raportează, de asemenea, o reprogramare extrem de eficientă a fibroblastelor de șoarece în celule stem neuronale induse ca celulele stem (ciNSLC) folosind un cocktail de nouă componente.

Au fost descrise mai multe metode de transformare directă a celulelor somatice în celule stem neuronale induse.

Experimentele de dovadă a principiului demonstrează că este posibilă transformarea fibroblastelor umane transplantate și a astrocitelor umane direct în creier care sunt proiectate pentru a exprima forme inductibile ale genelor de reprogramare neuronală, în neuroni, atunci când genele de reprogramare ( Ascl1 , Brn2a și Myt1l ) sunt activate după transplant folosind un medicament.

Astrocitele - cele mai frecvente celule neurogliale ale creierului, care contribuie la formarea cicatricilor ca răspuns la leziuni - pot fi reprogramate direct in vivo pentru a deveni neuroni funcționali care formează rețele la șoareci fără a fi nevoie de transplant de celule. Cercetătorii au urmărit șoarecii timp de aproape un an pentru a căuta semne de formare a tumorii și au raportat că nu au găsit niciunul. Aceiași cercetători au transformat astrocitele care formează cicatrici în celule progenitoare, numite neuroblaste, care s-au regenerat în neuroni în măduva spinării adultă rănită.

Celule precursoare oligodendrocitare

Fără mielină pentru izolarea neuronilor, semnalele nervoase își pierd rapid puterea. Bolile care atacă mielina, cum ar fi scleroza multiplă, duc la semnale nervoase care nu se pot propaga către terminațiile nervoase și, în consecință, duc la probleme cognitive, motorii și senzoriale. Transplantul de celule precursoare oligodendrocitare (OPC), care poate crea cu succes tecile de mielină în jurul celulelor nervoase, este un potențial răspuns terapeutic promițător. Conversia directă a fibroblastelor de șoarece și șobolan în celule oligodendrogliale oferă o sursă potențială de OPC. Conversia prin exprimarea forțată a celor opt sau a celor trei factori de transcripție Sox10, Olig2 și Zfp536, poate furniza astfel de celule.

Cardiomiocite

Terapiile in vivo pe bază de celule pot oferi o abordare transformativă pentru a spori creșterea vasculară și musculară și pentru a preveni formarea cicatricilor necontractile prin furnizarea de factori de transcripție sau microARN la inimă. Fibroblastele cardiace, care reprezintă 50% din celulele din inima mamiferelor, pot fi reprogramate in celule asemănătoare cardiomiocitelor in vivo prin livrarea locală a factorilor de transcripție a nucleului cardiac (GATA4, MEF2C, TBX5 și pentru reprogramare îmbunătățită plus ESRRG, MESP1, Myocardin și ZFPM2) după ligatură coronariană . Aceste rezultate au implicat terapii care pot remusculariza inima direct fără transplant de celule. Cu toate acestea, eficiența unei astfel de reprogramări s-a dovedit a fi foarte scăzută și fenotipul celulelor asemănătoare cardiomiocitelor primite nu seamănă cu cele ale unui cardiomiocit normal matur. Mai mult, transplantul factorilor de transcripție cardiacă în inimile murine rănite a dus la o supraviețuire slabă a celulelor și la o expresie minimă a genelor cardiace.

Între timp, au apărut progrese în metodele de obținere a miocitelor cardiace in vitro. Diferențierea cardiacă eficientă a celulelor iPS umane a dat naștere la progenitori care au fost reținuți în inimile șobolanilor infarctați și au redus remodelarea inimii după leziuni ischemice.

Echipa de oameni de știință, condusă de Sheng Ding, a folosit un cocktail de nouă substanțe chimice (9C) pentru transdiferențierea celulelor pielii umane în celulele cardiace care bat. Cu această metodă, peste 97% din celule au început să bată, o caracteristică a celulelor cardiace complet dezvoltate, sănătoase. Celulele asemănătoare cardiomiocitelor induse chimic (ciCM) s-au contractat în mod uniform și s-au asemănat cardiomiocitelor umane în proprietățile lor transcriptomice, epigenetice și electrofiziologice. Când au fost transplantate în inimile de șoareci infarctate, fibroblastele tratate cu 9C au fost transformate în mod eficient în ciCM și s-au dezvoltat în celule musculare ale inimii cu aspect sănătos din organ. Această abordare de reprogramare chimică, după optimizarea ulterioară, poate oferi o modalitate ușoară de a oferi indicii care determină regenerarea locală a mușchilor inimii.

Într-un alt studiu, cardiomiopatia ischemică în modelul de infarct murin a fost vizată de transplantul de celule iPS. S-a sincronizat cu ventriculii care se defectează, oferind o strategie regenerativă pentru a realiza resincronizarea și protecția împotriva decompensării datorită conducerii și contractilității ventriculare stângi îmbunătățite, cicatrizării reduse și inversării remodelării structurale. Un protocol a generat populații de până la 98% cardiomiocite din hPSC-uri pur și simplu prin modularea căii de semnalizare canonică Wnt la puncte de timp definite în timpul diferențierii, folosind compuși cu molecule mici ușor accesibile.

Descoperirea mecanismelor care controlează formarea cardiomiocitelor a condus la dezvoltarea medicamentului ITD-1, care curăță efectiv suprafața celulei de receptorul TGF-β tip II și inhibă selectiv semnalizarea intracelulară TGF-β. Astfel, îmbunătățește în mod selectiv diferențierea mezodermului necomandat de cardiomiocite, dar nu de mușchiul neted vascular și celulele endoteliale.

Un proiect a însămânțat inimi de șoarece decelularizate cu celule progenitoare cardiovasculare multipotențiale derivate de la iPSC umane. Celulele introduse au migrat, proliferat și diferențiat in situ în cardiomiocite, celule musculare netede și celule endoteliale pentru a reconstrui inimile. În plus, matricea extracelulară a inimii (substratul schelei inimii) a semnalat celulele umane să devină celulele specializate necesare pentru funcționarea corectă a inimii. După 20 de zile de perfuzie cu factori de creștere, țesuturile cardiace proiectate au început să bată din nou și au reacționat la medicamente.

Reprogramarea fibroblastelor cardiace în celule asemănătoare cardiomiocitelor induse (iCM) in situ reprezintă o strategie promițătoare pentru regenerarea cardiacă. Șoarecii expuși in vivo , la trei factori de transcripție cardiacă GMT (Gata4, Mef2c, Tbx5) și moleculele mici: SB-431542 (inhibitorul factorului de creștere transformator (TGF) -β) și XAV939 (inhibitorul WNT) timp de 2 săptămâni după ce infarctul miocardic a arătat o reprogramare semnificativ îmbunătățită (eficiența reprogramării a crescut de opt ori) și funcția cardiacă comparativ cu cele expuse doar GMT.

Vezi și: recenzie

Întinerirea celulei stem musculare

Vârstnicii suferă adesea de slăbiciune musculară progresivă și insuficiență regenerativă datorată parțial activității crescute a căii kinazei p38α și p38β activate mitogen în celulele stem ale mușchilor scheletici senescenți. Supunerea unor astfel de celule stem la inhibarea tranzitorie a p38α și p38β împreună cu cultura pe substraturi moi de hidrogel se extinde rapid și le întineresc, ceea ce duce la revenirea puterii lor.

La șoarecii geriatrici, celulele satelit aflate în repaus pierd pierdere reversibilă prin trecerea la o stare de pre-senescență ireversibilă, cauzată de derepresia p16 INK4a (numită și Cdkn2a). La rănire, aceste celule nu reușesc să se activeze și să se extindă, chiar și într-un mediu tineresc. Tacerea p16INK4a în celulele satelitare geriatrice restabilește funcțiile de liniște și regenerare musculară.

Progenitorii miogeni pentru utilizarea potențială în modelarea bolilor sau terapiile bazate pe celule care vizează mușchiul scheletic ar putea fi, de asemenea, generate direct din celule stem pluripotente induse folosind cultura sferică plutitoare liberă (sfere EZ) într-un mediu de cultură suplimentat cu concentrații mari (100 ng / ml) a factorului de creștere a fibroblastelor-2 ( FGF-2 ) și a factorului de creștere epidermică .

Hepatocite

Spre deosebire de protocoalele actuale pentru derivarea hepatocitelor din fibroblaste umane, Saiyong Zhu și colab., (2014) nu au generat iPSC-uri, dar, folosind molecule mici, au redus scurt reprogramarea la pluripotență pentru a genera o stare de celule progenitoare multipotente induse (iMPC) din care celule progenitoare endodermice și ulterior hepatocitele (iMPC-Heps) au fost diferențiate eficient. După transplantul într-un model de șoarece cu insuficiență hepatică umană cu deficiență imunitară, iMPC-Heps a proliferat pe scară largă și a dobândit niveluri ale funcției hepatocitelor similare cu cele ale hepatocitelor adulte primare umane. iMPC-Heps nu au format tumori, cel mai probabil pentru că nu au intrat niciodată într-o stare pluripotentă.

O criptă intestinală - o sursă accesibilă și abundentă de celule epiteliale intestinale pentru conversie în celule asemănătoare β.

Aceste rezultate stabilesc fezabilitatea repopulării hepatice semnificative a șoarecilor cu hepatocite umane generate in vitro, ceea ce elimină un obstacol de lungă durată pe calea terapiei cu celule hepatice autologe.

Un cocktail de molecule mici, Y-27632 , A-83-01 (un inhibitor al TGFβ kinazei / receptorului activinei precum kinaza ( ALK5 ) inhibitor) și CHIR99021 (inhibitor puternic al GSK-3 ), poate converti hepatocitele mature de șobolani și șoareci in vitro în celule bipotente proliferative - CLiPs (progenitori hepatici induși chimic). CLiPs se pot diferenția atât în ​​hepatocite mature cât și în celule epiteliale biliare care pot forma structuri funcționale ductale. În cultura pe termen lung, CLiP-urile nu și-au pierdut capacitatea proliferativă și capacitatea de diferențiere hepatică și pot repopula țesutul hepatic rănit cronic.

Celule producătoare de insulină

Complicațiile diabetului zaharat, cum ar fi bolile cardiovasculare , retinopatia , neuropatia , nefropatia și bolile circulatorii periferice, depind de dereglarea zahărului din cauza lipsei de insulină din celulele beta pancreatice și pot fi letale dacă nu sunt tratate. Una dintre abordările promițătoare pentru înțelegerea și vindecarea diabetului este utilizarea celulelor stem pluripotente (PSC), inclusiv a celulelor stem embrionare (ESC) și PCS induse (iPSC). Din păcate, celulele umane care exprimă insulina, derivate din PSC, seamănă mai degrabă cu celulele β fetale umane decât cu celulele β adulte. Spre deosebire de celulele β adulte, celulele β fetale par imature din punct de vedere funcțional, după cum se indică prin creșterea secreției bazale de glucoză și lipsa stimulării glucozei și confirmată de ARN-seq ale cărui transcrieri .

O strategie alternativă este conversia fibroblastelor către populații distincte de celule progenitoare endodermice și, folosind cocktailuri de factori de semnalizare, diferențierea cu succes a acestor celule progenitoare endodermale în celule funcționale beta, atât in vitro, cât și in vivo.

Supraexprimarea celor trei factori de transcripție , PDX1 (necesar pentru creșterea mugurilor pancreatici și maturarea celulei beta), NGN3 (necesar pentru formarea celulelor precursoare endocrine) și combinația MAFA (pentru maturarea beta-celulei) (numită PNM) poate duce la transformarea unele tipuri de celule într-o stare asemănătoare celulei beta. O sursă accesibilă și abundentă de celule funcționale producătoare de insulină este intestinul . Expresia PMN în „ organoidele ” intestinale umane stimulează conversia celulelor epiteliale intestinale în celule asemănătoare β posibil acceptabile pentru transplant .

Progenitori de nefron

Celulele tubulare proximale adulte au fost reprogramate direct transcripțional către progenitorii nefronici ai rinichiului embrionar , utilizând un grup de șase gene de factori de transcripție instructivi (SIX1, SIX2, OSR1, Eyes absent homolog 1 (EYA1), Homeobox A11 (HOXA11) și Snail homolog 2 (SNAI2)) care a activat gene în concordanță cu un fenotip progenitor mesenchim / nefron în linia celulară a tubului proximal adult. Generarea unor astfel de celule poate duce la terapii celulare pentru bolile renale adulte . Organoidele renale embrionare plasate în rinichii de șobolan adulți pot suferi o dezvoltare ulterioară și o dezvoltare vasculară.

Celulele vaselor de sânge

Pe măsură ce vasele de sânge îmbătrânesc, ele devin deseori anormale în structură și funcție, contribuind astfel la numeroase boli asociate vârstei, inclusiv infarct miocardic, accident vascular cerebral ischemic și ateroscleroză a arterelor care alimentează inima, creierul și extremitățile inferioare. Deci, un obiectiv important este de a stimula creșterea vasculară pentru circulația colaterală pentru a preveni exacerbarea acestor boli. Celulele progenitoare vasculare induse (iVPC) sunt utile pentru terapia pe bază de celule concepută pentru a stimula creșterea colaterală coronariană. Ele au fost generate de reprogramarea parțială a celulelor endoteliale. Angajamentul vascular al iVPC-urilor este legat de memoria epigenetică a celulelor endoteliale, care le generează ca componente celulare ale vaselor de sânge în creștere. De aceea, când iVPC-urile au fost implantate în miocard , acestea s-au îngrășat în vasele de sânge și au crescut fluxul colateral coronarian mai bine decât iPSC-urile, celulele stem mezenchimale sau celulele endoteliale native.

Modificarea genetică ex vivo poate fi o strategie eficientă pentru îmbunătățirea funcției celulelor stem. De exemplu, terapia celulară care utilizează modificarea genetică cu Pim-1 kinază (un efector în aval al Akt , care reglează pozitiv neovasculogeneza) celulelor derivate din măduva osoasă sau celulelor progenitoare cardiace umane, izolate de miocardul defect, are ca rezultat durabilitatea reparării, împreună cu îmbunătățirea parametrilor funcționali ai performanței hemodinamice miocardice.

Celulele stem extrase din țesutul adipos după liposucție pot fi direcționate pentru a deveni celule musculare netede progenitoare (iPVSMC) găsite în artere și vene.

Sistemul de cultură 2D al celulelor iPS umane coroborat cu selecția triplă a markerului ( CD34 (o glicofosfoproteină de suprafață exprimată pe fibroblastele embrionare timpurii de dezvoltare), NP1 (receptor - neuropilina 1) și KDR (receptor care conține domeniu de inserție kinază)) pentru izolarea celulele precursoare vasculogene din iPSC umane, au generat celule endoteliale care, după transplant, au format in vivo vase de sânge stabile și funcționale de șoarece in vivo, cu o durată de 280 de zile.

Pentru a trata infarctul, este important să se prevină formarea țesutului cicatricial fibrotic. Acest lucru poate fi realizat in vivo prin aplicarea tranzitorie a factorilor paracrini care redirecționează contribuțiile celulelor stem progenitoare ale inimii native din țesutul cicatricial în țesutul cardiovascular. De exemplu, într-un model de infarct miocardic de șoarece, o singură injecție intramiocardică a mARN-ului factorului de creștere endotelial vascular uman (VEGF-A modRNA), modificat pentru a scăpa de sistemul normal de apărare al corpului, are ca rezultat îmbunătățirea pe termen lung a funcției cardiace datorită mobilizării și redirecționarea celulelor progenitoare epicardice către tipuri de celule cardiovasculare.

Celule stem din sânge

globule rosii

Transfuzia RBC este necesară pentru mulți pacienți. Cu toate acestea, până în prezent aprovizionarea cu globule roșii rămâne labilă. În plus, transfuzia riscă transmiterea bolilor infecțioase. O cantitate mare de eritrocite sigure generate in vitro ar ajuta la soluționarea acestei probleme. Generarea de celule eritroide ex vivo poate oferi produse de transfuzie alternative pentru a îndeplini cerințele clinice prezente și viitoare. Celulele roșii din sânge (RBC) generate in vitro din celulele CD34 pozitive mobilizate au supraviețuire normală atunci când sunt transfuzate într-un destinatar autolog. RBC produse in vitro conțineau exclusiv hemoglobină fetală (HbF), care salvează funcționalitatea acestor RBC. In vivo s-a observat trecerea hemoglobinei fetale la cele adulte după perfuzia de precursori eritroizi nucleați derivați din iPSC. Deși eritrocitele nu au nuclei și, prin urmare, nu pot forma o tumoare, precursorii lor eritroblasti imediați au nuclei. Maturarea terminală a eritroblastelor în RBC funcționale necesită un proces complex de remodelare care se încheie cu extrudarea nucleului și formarea unui RBC enucleat. Reprogramarea celulară perturbă adesea enucleația. Transfuzia de eritrocite sau eritroblaste generate in vitro nu protejează suficient împotriva formării tumorii.

Calea receptorilor de hidrocarburi arii (AhR) (care s-a dovedit a fi implicată în promovarea dezvoltării celulelor canceroase) joacă un rol important în dezvoltarea normală a celulelor sanguine. Activarea AhR în celulele progenitoare hematopoietice umane (HP) determină o expansiune fără precedent a HP, celulelor genaice megacariocitare și eritroide. A se vedea, de asemenea, Revizuire concisă: gena SH2B3 codifică un regulator negativ al semnalizării citokinelor și a variantelor de pierdere a funcției care apar în mod natural în această genă, crește numărul de RBC in vivo. Suprimarea țintită a SH2B3 în celulele stem și hematopoietice primare umane a îmbunătățit maturarea și randamentul global al eritrocitelor derivate in-vitro. Mai mult, inactivarea SH2B3 prin editarea genomului CRISPR / Cas9 în celulele stem pluripotente umane a permis extinderea celulelor eritroide îmbunătățite cu diferențierea conservată. (A se vedea și prezentarea generală.)

Trombocite extrudate din megacariocite

Trombocite

Trombocitele ajută la prevenirea hemoragiei la pacienții trombocitopenici și la pacienții cu trombocitemie . O problemă semnificativă pentru pacienții multitransfuzați este refractaritatea la transfuziile de trombocite. Astfel, capacitatea de a genera ex vivo produse trombocitare și produse trombocitare lipsite de antigeni HLA în medii fără ser ar avea valoare clinică. Un mecanism bazat pe interferență ARN a folosit un vector lentiviral pentru a exprima ARNi cu ac scurt de păr care vizează transcripții β2-microglobuline în celule CD34-pozitive. Trombocitele generate au demonstrat o reducere cu 85% a antigenelor HLA de clasa I. Aceste trombocite par să aibă funcție normală in vitro

O strategie aplicabilă din punct de vedere clinic pentru derivarea trombocitelor funcționale din iPSC umană implică stabilirea unor linii de celule progenitoare megacariocitare stabile imortalizate (imMKCL) prin supraexprimarea BMI1 și BCL-XL dependentă de doxiciclină . ImMKCL-urile rezultate pot fi extinse în cultură pe perioade prelungite (4-5 luni), chiar și după crioconservare . Întreruperea supraexprimării (prin îndepărtarea doxiciclinei din mediu) a c-MYC, BMI1 și BCL-XL în imMKCL în creștere a dus la producerea de trombocite CD42b + cu funcționalitate comparabilă cu cea a trombocitelor native pe baza unei game de teste in vitro și in vivo. Thomas și colab., Descriu o strategie de programare directă bazată pe expresia exogenă simultană a 3 factori de transcripție: GATA1 , FLI1 și TAL1 . Megacariocitele programate înainte proliferează și se diferențiază în cultură timp de câteva luni, cu puritate megacariocitară peste 90%, ajungând până la 2x10 ⁵ megacariocite mature pe hPSC de intrare. Trombocitele funcționale sunt generate în întreaga cultură, permițând colectarea prospectivă a mai multor unități de transfuzie de la doar un milion de hPSC de pornire. Vezi și prezentare generală

Celulele imune

Un tip specializat de celule albe din sânge , cunoscute sub numele de limfocite T citotoxice (CTL), sunt produse de sistemul imunitar și sunt capabile să recunoască markeri specifici pe suprafața diferitelor celule infecțioase sau tumorale, determinându-le să lanseze un atac pentru a ucide dăunătorul. celule. De aici, imunoterapia cu celule T funcționale specifice antigenului are potențial ca strategie terapeutică pentru combaterea multor tipuri de cancer și infecții virale. Cu toate acestea, sursele celulare sunt limitate, deoarece sunt produse în număr mic în mod natural și au o durată de viață scurtă.

O abordare potențial eficientă pentru generarea de CTL-uri specifice antigenului este de a readuce celulele T imune mature în iPSC-uri, care posedă capacitate proliferativă nedefinită in vitro și, după înmulțirea lor, să le convingă să se redifferențeze înapoi în celule T.

O altă metodă combină tehnologiile iPSC și receptorul antigenic himeric (CAR) pentru a genera celule T umane direcționate către CD19 , un antigen exprimat de celule B maligne , în cultura țesuturilor. Această abordare a generării de celule T umane terapeutice poate fi utilă pentru imunoterapia cancerului și alte aplicații medicale.

Celulele T invariante natural killer (iNKT) au un potențial clinic mare ca adjuvanți pentru imunoterapia cancerului. Celulele iNKT acționează ca limfocite T înnăscute și servesc drept punte între sistemul imunitar înnăscut și dobândit . Acestea măresc răspunsurile antitumorale producând interferon-gamma (IFN-γ). Abordarea colectării, reprogramării / diferențierii, rediferențierii și injecției a fost propusă pentru tratamentul tumoral asociat.

Celulele dendritice (DC) sunt specializate pentru a controla răspunsurile celulelor T. DC cu modificări genetice adecvate poate supraviețui suficient de mult timp pentru a stimula CTL specific antigenului și după aceea poate fi complet eliminat. Celulele prezentatoare de antigen DC-like obținute din celule stem pluripotente induse de om pot servi ca sursă pentru terapia de vaccinare .

Proteina de legare CCAAT / amplificator-α (C / EBPα) induce transdiferențierea celulelor B în macrofage cu eficiență ridicată și îmbunătățește reprogramarea în celule iPS atunci când este coexprimată cu factorii de transcripție Oct4, Sox2, Klf4 și Myc. cu o creștere de 100 de ori a eficienței reprogramării celulelor iPS, implicând 95% din populație. Mai mult, C / EBPa poate converti limfomele celulare B umane selectate și liniile celulare de leucemie în celule asemănătoare macrofagelor cu eficiență ridicată, afectând capacitatea de formare a tumorii a celulelor.

Întinerirea celulelor epiteliale timice

Timusul este primul organ sa se deterioreze ca oameni de varsta. Această scădere este unul dintre principalele motive pentru care sistemul imunitar devine mai puțin eficient odată cu înaintarea în vârstă. Exprimarea diminuată a factorului de transcripție a celulelor epiteliale timice FOXN1 a fost implicată ca o componentă a mecanismului care reglementează involuția legată de vârstă.

Clare Blackburn și colegii săi arată că involuția timică stabilită legată de vârstă poate fi inversată prin reglarea forțată a unui singur factor de transcripție - FOXN1 în celulele epiteliale timice pentru a promova întinerirea , proliferarea și diferențierea acestor celule în epiteliu timic complet funcțional. Această întinerire și proliferare crescută a fost însoțită de reglarea ascendentă a genelor care promovează progresia ciclului celular ( ciclină D1 , ΔN p63 , FgfR2IIIb ) și care sunt necesare în celulele epiteliale timice pentru a promova aspecte specifice ale dezvoltării celulelor T ( Dll4 , Kitl , Ccl25 , Cxcl12 , Cd40 , Cd80 , Ctsl , Pax1 ). În viitor, această metodă poate fi utilizată pe scară largă pentru îmbunătățirea funcției imune și combaterea inflamației la pacienți prin întinerirea timusului in situ .

Celule stem mezenchimale

Inducţie

Celulele stem / stromale mezenchimale (MSC) sunt în curs de investigare pentru aplicații în repararea cardiacă, renală, neuronală, articulară și osoasă, precum și în condiții inflamatorii și cotransplant hemopoietic. Acest lucru se datorează proprietăților lor imunosupresoare și capacității lor de a se diferenția într-o gamă largă de țesuturi de linie mezenchimală. MSC sunt de obicei recoltate din măduva osoasă adultă sau grăsime, dar acestea necesită proceduri invazive dureroase și sunt surse de frecvență scăzută, constituind doar 0,001-0,01% din celulele măduvei osoase și 0,05% în aspirații de liposucție. De îngrijorare pentru utilizarea autologă, în special la persoanele în vârstă care au cea mai mare nevoie de repararea țesuturilor, MSC-urile scad în cantitate și calitate odată cu vârsta.

IPSC-urile ar putea fi obținute prin întinerirea celulelor chiar și a centenarilor. Deoarece iPSC-urile pot fi recoltate fără constrângeri etice și cultura poate fi extinsă la nesfârșit, ele sunt o sursă avantajoasă de MSC. Tratamentul IPSC cu SB-431542 duce la generarea rapidă și uniformă de MSC de la iPSC umane. (SB-431542 este un inhibitor al activin / căilor TGF prin blocarea fosforilării receptorilor ALK4 , ALK5 și ALK7 .) Aceste iPS-MSC pot lipsi capacitatea de formare a teratomului , prezintă un cariotip stabil normal în cultură și prezintă caracteristici de creștere și diferențiere care seamănă mult cu cele ale MSC primare. Are potențial pentru creșterea in vitro, permițând terapii bazate pe MSC. MSC derivate din iPSC au capacitatea de a ajuta regenerarea parodontală și sunt o sursă promițătoare de celule stem ușor accesibile pentru utilizare în tratamentul clinic al parodontitei.

Lai și colab., Și Lu raportează metoda chimică pentru a genera celule MSC-like (iMSCs), de la fibroblaste dermice primare umane folosind șase inhibitori chimici (SP600125, SB202190, Go6983, Y-27632, PD0325901 și CHIR99021) cu sau fără 3 factori de creștere (factor de creștere transformator-β (TGF-β), factor de bază de creștere a fibroblastelor (bFGF) și factor de inhibare a leucemiei (LIF)). Cocktailul chimic convertește direct fibroblastele umane în iMSC cu o cultură monostrat în 6 zile, iar rata de conversie a fost de aproximativ 38%.

Pe lângă terapia celulară in vivo, cultura celulelor stem mezenchimale umane poate fi utilizată in vitro pentru producția în masă a exosomilor , care sunt vehicule ideale pentru administrarea medicamentelor.

Adipocite diferențiate

Țesutul adipos , din cauza abundenței sale și a metodelor de recoltare relativ mai puțin invazive, reprezintă o sursă de celule stem mezenchimale (MSC). Din păcate, aspirații pentru liposucție sunt doar 0,05% MSC. Cu toate acestea, o cantitate mare de adipocite mature, care, în general, și-au pierdut abilitățile proliferative și, prin urmare, sunt în mod obișnuit aruncate, pot fi ușor izolate din suspensia de celule adipoase și diferențiate în celule asemănătoare fibroblastelor lipidice , denumite celule de grăsime diferențiate (DFAT) . Celulele DFAT restabilesc capacitatea de proliferare activă și exprimă capacități multipotente. Comparativ cu celulele stem adulte, celulele DFAT prezintă avantaje unice în abundență, izolare și omogenitate. În cadrul unei culturi de inducție adecvate in vitro sau a unui mediu adecvat in vivo, celulele DFAT ar putea demonstra potențiale adipogene, osteogene, condrogenice și miogene. De asemenea, ar putea prezenta caracteristici perivasculare și ar putea provoca neovascularizație.

Celulele condrogenice

Cartilajul este țesutul conjunctiv responsabil pentru mișcarea articulației fără frecare. Degenerarea sa duce în cele din urmă la pierderea completă a funcției articulare în stadiile târzii ale osteoartritei . Ca țesut avascular și hipocelular, cartilajul are o capacitate limitată de auto-reparare. Condrocitele sunt singurul tip de celule din cartilaj, în care sunt înconjurate de matricea extracelulară pe care o secretă și o asamblează.

O metodă de producere a cartilajului este de a-l induce din celulele iPS. Alternativ, este posibilă transformarea fibroblastelor direct în celule condrogenice induse (iChon) fără o etapă intermediară a celulei iPS, prin inserarea a trei factori de reprogramare (c-MYC, KLF4 și SOX9). Celulele umane iChon au exprimat gene marker pentru condrocite (colagen de tip II), dar nu și fibroblaste.

Implantate în defecte create în cartilajul articular al șobolanilor, celulele iChon umane au supraviețuit pentru a forma țesut cartilaginos cel puțin patru săptămâni, fără tumori. Metoda folosește c-MYC, despre care se crede că are un rol major în tumorigeneză și folosește un retrovirus pentru a introduce factorii de reprogramare, excluzându-l de la utilizarea nemodificată în terapia umană.

Surse de celule pentru reprogramare

Sursele cele mai frecvent utilizate pentru reprogramare sunt celulele sanguine și fibroblastele, obținute prin biopsia pielii, dar prelevarea celulelor din urină este mai puțin invazivă. Această din urmă metodă nu necesită biopsie sau prelevare de sânge. Începând cu 2013, celulele stem derivate din urină au fost diferențiate în linii endoteliale, osteogene, condrogenice, adipogene, miogene și neurogene scheletice, fără a forma teratoame. Prin urmare, memoria lor epigenetică este potrivită pentru reprogramarea în celule iPS. Cu toate acestea, puține celule apar în urină, au fost obținute numai eficiențe reduse de conversie și riscul de contaminare bacteriană este relativ ridicat.

O altă sursă promițătoare de celule pentru reprogramare sunt celulele stem mezenchimale derivate din foliculii de păr umani.

Originea celulelor somatice utilizate pentru reprogramare poate influența eficiența reprogramării, proprietățile funcționale ale celulelor stem rezultate și capacitatea de a forma tumori.

IPSC-urile păstrează o memorie epigenetică a țesutului lor de origine, ceea ce afectează potențialul lor de diferențiere. Această memorie epigenetică nu se manifestă neapărat în stadiul pluripotenței - iPSC derivate din diferite țesuturi prezintă morfologie adecvată, exprimă markeri de pluripotență și sunt capabili să se diferențieze în cele trei straturi embrionare in vitro și in vivo. Cu toate acestea, această memorie epigenetică se poate manifesta în timpul rediferențierii în tipuri specifice de celule care necesită loci specifici care poartă semne epigenetice reziduale.

Vezi si

Referințe

Lecturi suplimentare